氯沙坦對血管緊張素Ⅱ誘導人腎小球系膜細胞衰老作用機制的研究

焦素敏，傅淑霞，溫麗穎，閆 喆，李紹梅

腎臟功能隨年齡增長而下降，衰老是腎臟疾病進展的重要風險之一。目前導致腎臟衰老的機制仍未完全清楚，在眾多調控因素中氧化應激與腎素-血管緊張素系統(RAS)起著重要作用[1]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)為RAS系統的主要效應因子，已證實AngⅡ可以刺激內皮細胞、血管平滑肌細胞和血管成纖維細胞過氧化物的產生，導致氧化應激[2-4]。氧化應激是造成衰老的主要因素之一，其中自由基和活性氧(ROS)在生物大分子的氧化中起著重要的作用[5]，抑制氧化應激及AngⅡ受體信號途徑可減輕年齡相關的高血壓和代謝異常[6]。氯沙坦為AngⅡ的Ⅰ型受體拮抗劑,可阻斷AngⅡ與其Ⅰ型受體結合,從受體水平拮抗其生物學效應,從而降低腎小球毛細血管內壓,改善腎血流動力學異常,緩解早期的高濾過、高灌注狀態,減少尿蛋白,保護腎功能。既往研究證明，氯沙坦能夠改善老年冠心病患者內皮功能[7]，可以抑制結締組織生長因子(CTGF)、纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的表達,抑制細胞外基質的積聚,從而延緩D-半乳糖致大鼠腎臟的衰老[8]，而在急性冠狀動脈綜合征患者中，氯沙坦可減輕微粒誘導的內皮細胞的衰老[3]。氯沙坦作為AngⅡ的Ⅰ型受體拮抗劑，在各種原發及繼發腎臟疾病中廣泛應用，然而其是否可以減輕系膜細胞的衰老，及其可能的作用機制尚不清楚。本研究通過本課題組前期所建立的人腎小球系膜細胞衰老模型,即：培養至5～8代的細胞，用10-6mol/L AngⅡ刺激72 h[9]，觀察氯沙坦對AngⅡ誘導的人腎小球系膜細胞(HMCs)衰老的影響,細胞內ROS的變化,并測定p53、p21蛋白的表達,探討氯沙坦保護HMCs衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HMCs購于美國Sciencen公司。細胞在系膜細胞專用培養基(MsCM, ScienCell, USA)中培養，培養至5～8代的細胞用于實驗。氯沙坦(德國Merck公司)，AngⅡ(美國Sigma公司),細胞衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和ROS檢測試劑盒(中國碧云天)。小鼠抗人多克隆抗體β-actin,p21,兔抗人多克隆抗體P53(美國Santa Cruz)。

1.2實驗分組和處理 對照組:在不含AngⅡ的MsCM培養液中培養；Ang組:10-6mol/L AngⅡ刺激細胞72 h；氯沙坦+AngⅡ組:AngⅡ加入前l h加入10-5mol/L氯沙坦培養72 h。AngⅡ和氯沙坦的刺激濃度和時間由前期實驗所得[9]。

1.3SA-β-gal染色 各組細胞培養72 h后，PBS清洗細胞1次，按試劑盒說明書進行操作，染色后于37℃無CO2培養箱中孵育過夜，衰老的細胞染色后呈藍綠色，鏡下隨機選取6個視野分別計數衰老細胞數和總細胞數，計算SA-β-gal陽性細胞的百分率。

1.4流式細胞儀檢測細胞周期 各組細胞培養72 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液。60 g/min離心5 min，棄去培養液，PBS洗2次。加入70%冷乙醇4℃固定過夜，離心去乙醇。PBS洗2次后，懸浮于0.5 ml PBS中，分別加入RNaseA和PI 4℃避光顯色30 min上流式細胞儀對細胞周期進行檢測及分析。

1.5流式細胞儀檢測細胞內ROS 參照碧云天試劑盒說明書操作，即按1∶1000用無血清培養液稀釋熒光探針DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。各組細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為1×106～2×108/ml，37℃細胞培養箱內孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。流式細胞儀檢測細胞內ROS水平。

1.6蛋白免疫印跡法檢測p53、p21蛋白表達 各組細胞培養至相應時間后，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白加含β-巰基乙醇的上樣緩沖液，并于沸水中煮5 min，用12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離。電泳后電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，加兔抗人p53多克隆抗體(1∶400)，鼠抗人多克隆抗體β-actin(1∶500)，p21(1∶200)4℃搖床過夜，1×TBST洗膜3次，加二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶8000)，山羊抗鼠IgG(1∶8000)孵育雜交，室溫2 h,將ECL(增強化學發光)試劑盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，反應1 min后，在發光儀上發光。

2 結果

2.1細胞SA-β-gal染色變化 對照組、AngⅡ處理組和氯沙坦干預組SA-β-gal染色陽性細胞百分率分別為(13.03±0.96)%、(80.64±1.34)%、(29.37±0.78)%。對照組和氯沙坦干預組SA-β-gal染色陽性細胞百分率低于AngⅡ處理組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2細胞周期變化 對照組、AngⅡ處理組和氯沙坦干預組G0/G1期細胞比例分別為(52.81±2.53)%、(77.18±1.11)%和(60.6±0.80)%。對照組、氯沙坦干預組G0/G1期細胞比例低于AngⅡ處理組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 3組人腎小球系膜細胞細胞周期變化

2.3細胞內ROS水平變化 AngⅡ處理組人腎小球系膜細胞ROS水平高于對照組和氯沙坦干預組(P<0.05)。見圖3。

圖3 3組人腎小球系膜細胞細胞內活性氧含量變化

2.4p53和/p21蛋白表達水平的變化 AngⅡ處理組p53和/p21蛋白較對照組增高，氯沙坦干預組低于AngⅡ處理組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 3組人腎小球系膜細胞p53和/p21蛋白表達水平

3 討論

許多年齡相關疾病(age-related disease， ARD)包括心腦血管疾病、神經退行性變、腎臟疾病等發病率也在逐年增高。其中腎臟是受年齡影響比較明顯的器官之一，腎小球濾過率(GFR)隨年齡增長每年下降0.40～1.02 ml/min[10],老年腎臟疾病正逐漸成為影響人們健康和社會發展的主要疾病，因此研究腎臟衰老機制及研發干預藥物具有重要意義。

關鍵細胞的衰老是器官和組織衰老的病理基礎，腎小球系膜細胞作為腎臟重要的固有細胞，其表型和功能的改變在腎臟衰老進程中必然發揮著重要的作用。多數正常細胞在體外培養時不能無限傳代，而是經過一個時期的增殖后，分裂速度降低，最后停止，對任何有絲分裂原無反應，稱為“復制性衰老”。有研究報道，正常細胞在各種應激下，如DNA損傷、氧化應激、癌基因激活等，可以快速進入衰老，稱為“應激性衰老”[11]。有關衰老機制的假說和理論眾多，如基因功能紊亂、線粒體損傷和干細胞耗竭等[12]。然而，目前最公認的衰老學說之一仍是氧化應激學說。在正常情況下，機體處于氧化與抗氧化的動態平衡狀態，從而保護機體免受損傷。隨著年齡增長或在外界有害刺激因素下，機體內ROS的數量會顯著增多，造成脂質過氧化反應，引起機體內包括蛋白、核酸等的氧化損傷，對細胞功能和活性造成損害，可以說衰老是自由基損傷性效應的綜合結果[13-14]。多種分子通路參與調控衰老的過程，如MAPK/NF-kB通路、抑癌基因PTEN、Klotho蛋白等[15-17]，但是現公認各種誘發細胞衰老的信號最后主要通過p53-p21-PRb途徑和p16-PRb途徑導致衰老[18]，細胞衰老后具有細胞周期阻滯于G0/G1期、SA-β-gal表達增加等特征性改變。

p53蛋白不僅是重要的細胞周期、凋亡調節因子，還是細胞衰老過程中重要的調節因子，能感知衰老相關信號的刺激，如端粒縮短、DNA損傷等。p53被激活時結合到DNA特殊的序列上并增強其下游靶基因的表達。p53活化的一個主要效應分子就是p21，p21蛋白為廣譜的細胞周期蛋白,是依賴于細胞周期蛋白激酶(CDK)的抑制物，p21水平上調可抑制CDK2和CDK4的活性,使其不能磷酸化視網膜母細胞瘤抑制蛋白(Rb)，Rb是CDK4-6/D激酶的主要底物，處于非磷酸化或低磷酸化形式的Rb可與轉錄因子E2F結合，屏蔽其轉錄激活結構域，抑制其轉錄活性，而后者能激活重要的細胞周期蛋白E和A，啟動DNA復制，從而抑制了從G1期進入S期所需的下游基因的表達，使細胞周期停滯[16]。

有研究證實，RAS系統參與器官衰老過程[19-20],血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)可降低腎小球內壓和蛋白尿，減輕局灶節段性腎小球硬化和間質纖維化。氯沙坦作為血管緊張素受體拮抗劑經典藥物之一，廣泛用于各種腎臟疾病，但對于其在腎小球系膜細胞衰老中的作用報道尚少。

本實驗應用AngⅡ刺激HMCs，成功建立HMCs衰老模型，衰老細胞中p53、p21蛋白表達增多，說明p53/p21通路參與了AngⅡ誘導的HMCs的衰老過程，應用氯沙坦干預后，細胞內ROS水平降低，p53、p21表達下降，提示氯沙坦可能通過減輕氧化應激，調控p53/p21通路而延緩HMCs的衰老過程，為臨床應用氯沙坦治療衰老相關性腎臟疾病提供了理論依據,但是具體應用到臨床還有待于基礎研究的進一步深入和大規模的臨床實驗來證實。另外，至于P16-PRb通路是否也參與了AngⅡ誘導的HMCs的衰老過程亦需要進一步證實。

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