熊果酸對動脈粥樣硬化大鼠氧化應激和炎性反應的影響

王金艷，孟祥茹，肖亞利，楊曉龍

(涿州市醫院心血管內一科，河北 涿州 072750)

動脈粥樣硬化(AS)的發病機制非常復雜[1-2]，其中氧化應激損傷和炎性反應在AS的發生發展過程中發揮著關鍵作用[3-4]。熊果酸(UA)是一種具有抗氧化、抗炎等多種生物學活性的五環三萜類化合物[5-6]，但UA是否對AS大鼠氧化應激損傷和炎性反應具有抑制作用尚未見文獻報道。本實驗通過高脂飼料喂養結合腹腔注射VD3的方法建立AS大鼠模型，并同步給予UA進行干預治療，研究UA對AS大鼠氧化應激和炎性反應的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

UA購自陜西慧科植物開發有限公司(純度≥98%)；辛伐他汀片購自山東方明藥業股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、活性氧簇(ROS)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)試劑盒和蘇木精-尹紅(HE)試劑盒均購自北京博奧森科技有限公司。

1.2 動物

清潔級雄性SD大鼠(清潔級，鼠齡6周齡，體質量180～220 g)購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 方法

1.3.1AS大鼠模型的制備、分組與給藥 本實驗將通過制備AS大鼠模型，并于開始制備模型時便開始灌胃給予UA進行干預治療，通過相關指標檢測并參照健康對照組和陽性藥辛伐他汀(SV)干預組實驗數據，進而研究分析UA對AS大鼠氧化應激以及炎性反應的影響。取120只實驗用大鼠根據體質量采用隨機數字表法隨機分為健康對照組、模型組、UA(10、20、40 mg·kg-1·d-1)干預組和SV(1.8 mg·kg-1·d-1)干預組，各組均為20只。參照楊宏輝等[7]報道的實驗方法，通過喂食高脂飼料結合腹腔注射VD3的方法建立AS大鼠模型，健康對照組喂食正常飼料并腹腔注射生理鹽水，共12周。造模開始同一天，各組大鼠即開始灌胃給藥，健康對照組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，共12周。治療完成后，取材并進行各指標檢測。

1.3.2血清中抗氧化酶活性和MDA、ROS含量的測定 麻醉后經腹主動脈取血，離心(2 000 r·min-1，離心半徑：4.9 cm，10 min)取血清，依照試劑盒說明書步驟進行處理，采用比色法測定血清中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性和MDA、ROS含量。

1.3.3血漿中炎性細胞因子含量的測定 取血漿并按照ELISA試劑盒說明進行處理，通過酶標儀測定血漿中炎性細胞因子(CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)含量水平。

1.3.4主動脈形態結構改變的觀察及病變分級 麻醉后剝取全長主動脈，經4%多聚甲醛液中固定、常規脫水、石蠟包埋、切片、常規HE染色、復染和封片處理后，通過顯微鏡觀察主動脈形態結構改變；主動脈病變標準[8]：0級：結構正常；1級：內膜有少量泡沫細胞積聚，無明顯的凸起斑塊；2級：內膜可見大量泡沫細胞積聚，有明顯的粥樣斑塊，部分斑塊融合成片；3級：內膜表面幾乎全被粥樣斑塊覆蓋，斑塊內可見組織壞死、鈣化，斑塊底部肌層萎縮變薄。

1.4 統計學方法

采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，多組間均數比較采用one-way ANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗；主動脈病變分級采用秩和檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中抗氧化酶活性

結果如表1所示：模型組大鼠血清中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性較健康對照組顯著降低(P<0.01)；與模型組比較發現，經UA(20、40 mg·kg-1·d-1)干預能夠顯著改善AS大鼠血清中SOD、CAT活性(P<0.05，P<0.01)，其中40 mg·kg-1·d-1干預組GSH-Px活性較模型組顯著升高(P<0.05)；SV 1.8 mg·kg-1·d-1干預組大鼠血清抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性較模型組差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清中抗氧化酶活性

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 各組大鼠血清中MDA、ROS含量

結果如表2所示：模型組大鼠血清中MDA、ROS含量較健康對照組均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較發現經UA(20、40 mg·kg-1·d-1)或SV 1.8 mg·kg-1·d-1干預能夠顯著降低AS大鼠血清中MDA、ROS含量(P<0.05，P<0.01)。

2.3 各組大鼠血漿中炎性細胞因子含量

結果如表3所示：模型組大鼠血漿中炎性細胞因子(CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6)含量較健康對照組均顯著升高(P<0.01)，而炎性細胞因子IL-10含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較發現經UA(20、40 mg·kg-1·d-1)干預能夠顯著降低AS大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05，P<0.01)，其中UA 40 mg·kg-1·d-1干預組IL-10含量較模型組顯著升高(P<0.01)；SV 1.8 mg·kg-1·d-1干預組大鼠血漿TNF-α含量水平較模型組顯著降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血漿中炎性細胞因子含量

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表2 各組大鼠血清中MDA、ROS含量

注：與健康對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4 各組大鼠主動脈形態結構改變及病變分級

通過顯微鏡觀察HE染色病理切片，結果如圖1所示：模型組大鼠主動脈較健康對照組呈現內皮細胞受損、慢性炎性病變、泡沫細胞形成，并伴有粥樣硬化斑塊形成等明顯的病理性形態結構改變；與模型組比較，發現經UA預處理能夠明顯減輕AS病變程度。主動脈病變分級結果如表4所示：模型組大鼠主動脈病變2級及以上共17例(85%)，模型組病變分級較健康對照組顯著升高(P<0.01)；UA 40 mg·kg-1·d-1干預組和SV 1.8 mg·kg-1·d-1干預組主動脈病變分級較模型組均顯著降低(P<0.01)。

3 討論

AS的病理機制非常復雜，近年來“氧化反應學說”和“炎性學說”逐漸得到認可，王爽等[9]和沈建飛等[10]經動物實驗研究發現通過藥物抑制氧化應激和炎性反應能夠抑制AS的發生發展。

表4 各組大鼠主動脈病變分級/只

注：與健康對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.01。

UA是一種具有抗氧化、抗炎等多種生物學活性的五環三萜類化合物，本實驗研究結果顯示：與模型組比較發現經UA(10、20、40 mg·kg-1·d-1)干預能夠有效抑制AS大鼠主動脈病變，其中UA 40 mg·kg-1·d-1組主動脈病變分級較模型組顯著降低(P<0.01)，提示UA對AS大鼠具有一定的保護作用。

氧化應激損傷在AS的發生及其發展過程中起著非常重要的作用，ROS本身并不損傷血管，但ROS生成的活性氧和NO將破壞血管壁的光滑性，從而形成斑塊、斑塊破裂與形成血栓[12-13]。常態下ROS的產生與清除處于動態平衡，其中體內抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)在ROS的清除過程中發揮著重要的催化作用[14-15]；而當抗氧化酶活性降低時將導致ROS過剩，導致動脈血管的過氧化損傷；因此，過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映動脈血管氧化應激損傷程度。本實驗研究結果顯示：與模型組比較發現經UA(20、40 mg·kg-1·d-1)干預能夠顯著提高抗氧化酶(SOD、CAT)活性并顯著降低MDA、ROS含量(P<0.05，P<0.01)，40 mg·kg-1·d-1組優于20 mg·kg-1·d-1組；并且40 mg·kg-1·d-1干預組GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，提示UA具有降低AS大鼠氧化應激損傷的作用。

Ovsepyan等[16]研究發現，AS斑塊將促進巨噬細胞分泌大量促炎性細胞因子(CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6)并抑制抑炎性因子IL-10的分泌，從而介導炎性反應的發生，誘導平滑肌細胞的凋亡、促進AS發展。本實驗研究結果顯示：與模型組比較發現經UA(20、40 mg·kg-1·d-1)干預能夠顯著降低AS大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05，P<0.01)，并且40 mg·kg-1·d-1組IL-10含量顯著升高(P<0.01)，提示UA具有抑制AS大鼠炎性反應的作用。

綜上所述，經UA干預能夠有效改善AS大鼠抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷，抑制炎性反應，從而表現出UA對AS大鼠具有一定的保護作用。

(本文圖1見插圖5-1)

[1] WANG CN,LIU CW,LAI ZC,et al.Logistic regression analysis of depression in Aarteriosclerosis obliterans patients and its risk factors[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao,2015,37(5):557-561.

[2] ZIQIANG X,JINGJUN W,JIANJIAN Z,et al.Tadalafil attenuates graft arteriosclerosis of aortic transplant in a rat model[J].Iran J Basic Med Sci,2015,18(9):927-931.

[3] QIANG G,WENZHAI C,HUAN Z,et al.Effect of Sancaijiangtang on plasma nitric oxide and endothelin-1 levels in patients with type 2 diabetes mellitus and vascular dementia:a single-blind randomized controlled trial[J].J Tradit Chin Med,2015,35(4):375-380.

[4] 宋磊,錢之玉,陳真,等.動脈粥樣硬化與炎癥的關系及相關治療藥物[J].藥學進展,2013,37(2):49-57.

[5] 郝冉冉,王晨靜,仲偉珍,等.熊果酸對ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的保護作用[J].中藥藥理與臨床,2014,30(4):29-32.

[6] 譚娟,黃微,陳善龍,等.熊果酸衍生物與查耳酮綴合物的合成及抗炎活性[J].藥學學報,2016,51(6):938-946.

[7] 楊宏輝,高傳玉,徐予,等.動脈粥樣硬化SD大鼠模型的建立[J].醫藥論壇雜志,2009,30(2):18-22.

[8] 王偉,楊濱,王嵐,等.丹參山楂藥對對大鼠動脈粥樣硬化的影響[J].中國中藥雜志,2011,36(6):784-789.

[9] 王爽,陳瀟,孟國梁,等.靈芝多糖對動脈粥樣硬化大鼠氧化應激的影響[J].中藥藥理與臨床,2011,27(6):38-42.

[10] 沈建飛,盛一梁,徐丹,等.降脂丸對動脈粥樣硬化大鼠模型炎癥因子表達的影響[J].中國醫院藥學雜志,2013,33(19):1600-1603.

[11] CONSIDINE MJ,SANDALIO LM,FOYER CH.Unravelling how plants benefit from ROS and NO reactions,while resisting oxidative stress[J].Ann Bot,2015,116(4):469-473.

[12] QIANG G,WENZHAI C,HUAN Z,et al.Effect of Sancaijiangtang on plasma nitric oxide and endothelin-1 levels in patients with type 2 diabetes mellitus and vascular dementia:a single-blind randomized controlled trial[J].J Tradit Chin Med,2015,35(4):375-380.

[13] LARTIGUE A,BURLAT B,COUTARD B,et al.The megavirus chilensis Cu,Zn-superoxide dismutase:the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J].J Virol,2014,2588(14):254-261.

[14] 劉穎,譚波宇.烏頭提取物對心衰大鼠抗氧化能力的研究[J].安徽醫藥,2015,19(9):1661-1664.

[15] 劉秀芳,李婷婷,蔡光明,等.小葉黑柴胡莖葉總黃酮體外抗氧化活性的研究[J].中南藥學,2011,9(3):173-175.

[16] OVSEPYAN VA,GABDULKHAKOVA AKH,SHUBENKIVA AA,et al.Role of Interleukin-10 Gene Promoter Region Polymorphism in the Development of Chronic Lymphoid Leukemia[J].Bull Exp Biol Med,2015,160(2):275-277.