纖溶酶原核表達及功能分析

強萌萌，伍麗娜，宋翔，方旭東，李釩

（天津渤海職業技術學院，天津300402）

目前，普遍將能夠專一性降解纖維蛋白凝膠的蛋白水解酶稱為纖溶酶（plasmin）。在人類或者動物體內具有凝血和纖溶兩個系統，它們的存在是相互關聯的，功能上是互相依托的，[3]。眾所周知，當機體由于某種原因發生了凝血反應后，幾乎是與此同時往往激活機體的纖溶系統，導致體內多余的血栓發生遷移，機體出現負反饋效應降低體內纖維蛋白原的水平，避免出現纖維蛋白的過多凝聚的現象[4],激活的纖溶酶可降解纖維蛋白和纖維蛋白原。目前，纖溶酶是首個直接作用于血栓前體蛋白的降纖藥[5]。同時，目前市售的纖溶酶制品的生產原料的來源大部分為動物血漿,這類纖溶酶產品在使用上不僅可能會引起人體的異源性免疫反應還具有傳播動物疾病的風險。基于這種現狀，我們認為即安全又大量的生產纖溶酶迫在眉睫[6]。因此，我們利用所學知識認為應當制備人源纖溶酶用于生產。本論文利用生物技術、分子生物學、基因工程和化學工程技術等實現纖溶酶在原核中的表達，同時進行體外培養的研究、進行了生產纖溶酶的可行性研究，取得了一定研究成果,這些將成為未來纖溶酶制備的一個新的發展方向,在現代生物化工產業中具有良好的前景。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮混和血漿由天津市血液中心提供；PCR儀（美國Bio-Rad Laboratories公司）；核酸蛋白分析儀（美國Bio-Rad Laboratories公司）；GeneGenius全自動凝膠成像系統（Syngene公司）；752N型紫外可見光分光光度計：上海精研；CR21G高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）；PET-40b載體（載體質粒為Promega生物技術有限公司）；T4 DNA連接酶(Ta-KaRa公司)；BamHⅠ(TaKaRa公司)XhoⅠ(TaKaRa公司)；Bl-21大腸桿菌（sigma公司產品）；細胞培養板:為NUNC公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 纖溶酶因子RNA的提取

采集人體血樣，從人體血樣中提取人源RNA。

1.2.2 cDNA的獲取

將上述提取的人源RNA進行逆轉錄，獲取纖溶酶表達基因的cDNA。

1.2.3 PCR反應

在NCBI基因組數據庫中查到的人源的纖溶酶序列，提取所需的cDNA，以其為模板利用PCR（聚合酶連接技術）擴增纖溶酶的基因。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增基因產物后，進行切膠回收[7]。

1.2.4 雙酶切反應

PCR產物雙酶切體系，將PCR回收產物進行雙酶切反應為：質粒 15uL、ddH2O6uL、10×Tango buffer6uL、BamHI(10U/uL)1.5uL、XhoI(10U/uL)1.5uL、總計30uL。

1.2.5 連接反應

根據需要通過一系列的對比研究選取了PET-40b為載體，pET-40b質粒（見圖1）表達載體為原核生物高效表達載體。在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為10μL。質粒載體：2uL，10×T4 buffer：1uL，T4 連接酶：1uL，目的片段：6uL，總計10uL。16℃，2～4h后，放入4℃冰箱中過夜。

1.2.6 轉化

重組子轉化E.coli BL21：制備一定量的E.coli BL21感受態細胞，分裝為100μL每只待用。

將需要的目的連接產物轉化入前期制備完成的100μL感受態大腸桿菌中，均勻涂布于LB固體培養基上（含有抗生素Kan 100μg/mL）表面，待包含目的產物的感受態細胞充分滲入培養基后，放于37℃中培養 12h[8]。

1.2.7 驗證

提取相關質粒后分別進行雙酶切以及DNA測序驗證。

圖1 pET-40b質粒圖譜

1.2.8 最佳誘導條件的確定

對轉入的重組E.coli BL21進行擴培，接菌量為1%，并加入0.1%的Kan，以5mL為一樣品量在LB培養基中進行培養。收集菌體后破碎菌體，離心收集沉淀，于100℃下煮沸10min。置于4℃下保存[9]。

1.2.9 鎳柱法純化融合蛋白

因為在pET-40b載體上帶有His-Tag，因此可采用固定金屬離子親和色譜法（IMAC）去純化融合蛋白。

1.2.10 樣品準備

收集培養發酵液，用超聲探頭將混合菌體在冰水中進行破碎。

1.2.11 酶活的測定

纖維蛋白平板法驗證產物活性將經蛋白質凝膠電泳分析后分子量與目的產物相同的菌株擴大培養后，收集菌體，超聲破碎，得到蛋白上清。在事先準備好的纖維蛋白平板上用打孔器進行打孔，加入蛋白上清和1標準品10μL，37℃下培養12h，觀察溶栓圈[11]。

2 試驗結果

2.1 擴增目的片段

圖2 PCR產物凝膠電泳分析

圖3 質粒提取凝膠電泳分析分析

圖4 酶切凝膠電泳分析

2.2 纖溶酶酶活力測定標準曲線的繪制（見圖5）

2.3 酶促反應溫度的選擇（圖6）

圖6 反應溫度對纖溶酶酶活的影響

由圖6可見，當溫度為35℃時，纖溶酶的酶活最高，為37.69 U/mg蛋白。

3 討論

通過相關生物工程技術進行研究的過程是首先將需要的目的基因利用DNA重組技術連接在特定的載體上，隨后將連接成功的目的性產物導入到相應的靶細胞（微生物，動物細胞、人體細胞、昆蟲細胞、植物細胞），實現在選定的靶細胞內表達目的基因的目的，最后將研究所得的需要表達的目的蛋白質進行提純，從而實現目的基因的體外表達[12]，進而投入生產應用。

通過以上實驗我們發現，纖溶酶可以在大腸桿菌中實現表達，進而進行體外培養。在國外的研究領域已開展了相關生物工程和化學工程的方法來制備纖溶酶的研究,這是未來制備纖溶酶的一個新思路和新方向。

參考文獻：

［1］杜平中.溶栓藥物研究新進展[J].中國新藥雜志.2001(08).

［2］劉熔增,莫煒,于敏.纖溶酶及其衍生物溶栓研究進展[J].國際藥學研究雜志,2014,41(03):313-317.

［3］閻家麒,童巖,臧瑩安.豆豉纖溶酶的純化及其性質研究[J].藥物生物技術,2000,(03):149-152.

［4］謝秋玲,孫奮勇,廖美德等.納豆激酶原基因的克隆及表達[J].華南理工大學學報(自然科學版).2002(06).

［5］陳維金,孫宏,關鋒等.Lys-纖溶酶原的制備及其活力穩定性[J].中國生物制品學雜志，2000(04).

［6］方亮,鄒漢武.人纖維蛋白溶酶原和人纖維蛋白溶酶的研制進展[J].中國輸血雜志,2015,28(01):94-97.

［7］Xiaoxin Li,Xuan Shi,Jingyu Fan.Posterior vitreous detachment with plasmin in the isolated human eye[J].Graefe’s Archive for Clini?cal and Experimental Ophthalmology.2002(1).

［8］Crumrine R Christian,Marder Victor J,Taylor G McLeod,et al.Safe?ty evaluation of a recombinant plasmin derivative lacking kringles 2-5 and rt-PA in a rat model of transient ischemic stroke.Experi?mental&translational stroke medicine,2012.

［9］Jeon Je-Seung,Kim Jeeyoung,Park Soyoung,et al.Preparative puri?fication of plasmin activity stimulating phenolic derivatives from Gastrodia elata using centrifugal partition chromatography.[J].Bio?medical chromatography:BMC,2016,30(6).

［10］Victor J.Marder,Ales Blinc,Theresa Gruber,et al.Comparison of Plasmin With Recombinant Tissue-Type Plasminogen Activator in Lysis of Cerebral Thromboemboli Retrieved From Patients With Acute Ischemic Stroke[J].Stroke,2011(8).

［11］Remil Aguda,Anthony Caronna,Jennifer Hunt,et al.Production and purification of TAL6003:A novel version of the protease plas?min[J].Protein Expression and Purification，2013(1).

［12］Jeon Je-Seung,Kim Jeeyoung,Park Soyoung,et al.Preparative pu?rification of plasmin activity stimulating phenolic derivatives from Gastrodia elata using centrifugal partition chromatography.[J].Bio?medical chromatography:BMC,2016(6).