勝紅薊根系分泌物土壤浸提液在石榴枯萎病生物防治中的作用初探

黃邦成，魏丹麗，李 銣，湯東生

（云南農業大學植物保護學院，昆明650201）

0 引言

由甘薯長喙殼引起的石榴枯萎病堪稱石榴的“癌癥”，采用化學藥劑澆灌和生物菌劑處理均不能減輕病害的發生，亦不能控制其擴展蔓延[1]。增加地表植被，改善土壤生態條件，可優化土壤微生物定殖環境，提高生防菌劑防治土傳病害的效果[2-3]。湯東生等[4]研究表明在石榴周圍種植雜草勝紅薊可有效控制石榴枯萎病[1]。但勝紅薊在石榴根際定植以后，如何作用于石榴枯萎病的致病過程并不清楚，因此，有必要深入揭示勝紅薊在石榴枯萎病生防中的作用機理。

植物定植土壤以后，可通過根系分泌物、淋溶物和組織分解產物影響到土壤生態環境[5-7]和根際微生物區系[8]。其中根系分泌物與土壤中的微生物接觸最密切，因此其對土壤微生物菌群的消長作用備受關注[9-10]。根系分泌物可以通過抑制土壤中病菌的生長，而控制土傳病害的發展。室內試驗表明，當旱稻與西瓜間作后，早稻根系分泌物顯著抑制西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)生長，而西瓜自身根系分泌物促進枯萎病菌的生長[11]。田間試驗表明，間作韭菜能顯著減輕香蕉枯萎病的發生，是因為韭菜根系分泌物抑制導致香蕉枯萎病菌孢子的萌發和菌絲生長[12]。油菜輪作煙草以后，油菜的根系分泌物質吸引游動孢子隨后抑制休眠孢子萌發和菌絲生長達到控制油菜黑脛病[13]。另一些研究證實，根系分泌物通過影響根際微生物種群結構來減輕土傳病害的發展。鳳梨輪作香蕉后，香蕉枯萎病發生率和危害率的降低不是由于鳳梨的根系分泌物抑制枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace 4)的生長，而是擴大了土壤中微生物的多樣性，從而減少了枯萎病菌的生長與擴展[14]。有研究表明香蕉根系分泌的有機酸類物質植物生長促生菌Bacillus amyloliquefaciens的定殖，從而免于受到土傳病害的發展[15]。

從調控生物防治效果的角度來分析，植物的根系分泌物質或是通過增加生防菌的生物活性或抑制病原菌的活力增殖，亦或兩者兼起作用。勝紅薊在土壤定植后，是促進了生防菌枯菌芽孢桿菌的定植，還是對石榴枯萎病菌有直接的抑制作用，還是2種作用方式均存在，需要用試驗來證明。筆者利用勝紅薊的土壤浸提液代表根系分泌物，在室內分別處理生防菌枯草芽孢桿菌和石榴枯萎病菌，通過檢測枯草芽孢桿菌和石榴枯萎病菌的增殖速度，判明勝紅薊根系分泌物的作用途徑，旨在為深入揭示利用勝紅薊生態防控石榴枯萎病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試植物與菌株

勝紅薊苗由采用石榴園的野生植物種子經實驗室培育所得。供試菌株為由實驗室保存的對石榴枯萎病有強烈抑制作用的枯草芽孢桿菌菌株BS5102。

1.2 供試培養基

1.2.1 PDA培養基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g，1000 mL純水。

1.2.2 YPG培養基 酵母膏5 g，胰蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，瓊脂15 g，1000 mL純水。

1.3 勝紅薊土壤浸提液的獲取

采用土培法獲取，在土培的勝紅薊生長至5葉期后，將主根周圍4 cm、深10 cm的土壤全部取出，加蒸餾水浸提，蒸餾水體積與土壤體積比為2:1，將所得根際泥水攪拌均勻后5000 r/min離心，先用定性濾紙過濾3遍，再用孔徑0.2 μm的細菌過濾器過濾，即得到無菌的勝紅薊根系分泌物土壤浸提液。

1.4 勝紅薊土壤浸提液對枯草芽孢桿菌的作用

將收集好的勝紅薊土壤浸提液與制備好的去瓊脂YPG培養液按7:3、5:5、3:7的比率配制成50 mL培養液裝于100 mL錐形瓶中，接入濃度為2.3×107cfu枯草芽孢桿菌菌液1 mL，并以清水與YPG培養液以同樣比例混合為對照，3次重復，放于恒溫振蕩器(30℃，120 r/min)上培養，12 h后取5 mL菌液用UV1000紫外分光光度計開始測量吸光值，每2 h測1次吸光值，并記錄數據。所有試驗重復2遍。

1.5 勝紅薊土壤浸提液對石榴枯萎病菌的作用

將勝紅薊土壤浸提液按照體積比加入到滅菌尚未凝固的PDA培養基(45℃)中配成兩者體積比為7:3、5:5、3:7的培養基，待凝固后接種直徑為1 cm的石榴枯萎病菌餅于培養基中央。并以清水與PDA培養基以同樣比例混合為對照，3次重復，放于電熱恒溫培養箱中培養，第3天后用十字交叉法測量菌餅直徑并記錄，之后每天測量，直至對照出現菌落長滿整個培養皿為止。所有試驗重復2遍。

1.6 數據統計與分析

使用Excel和SAS 9.1軟件分析數據，用Duncan’s新復極差法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 勝紅薊土壤浸提液對枯草芽孢桿菌生長的影響

勝紅薊土壤浸提液促進生防菌枯草芽孢桿菌的生長（圖1～3）。不論YPG營養液的比例如何，在同樣比例YPG營養液條件下，添加土壤浸提液的處理，枯草芽孢桿菌的生長呈現剛開始緩慢增長，而后快速生長的趨勢；而添加清水的處理，枯草芽孢桿菌的生長呈現剛開始生長較快，而后停止生長的趨勢。在所有處理中，當枯草芽孢桿菌培養18 h以后，勝紅薊土壤浸提液處理的枯草芽孢桿菌的數量均高于對應的清水處理的芽孢桿菌的數量。如在培養24 h時，當YPG含量為70%時，土壤浸提液處理的枯草芽孢桿菌數量是清水處理的枯草芽孢桿菌的28倍；當YPG含量為50%時，土壤浸提液處理的枯草芽孢桿菌數量是清水處理的枯草芽孢桿菌的17倍；當YPG含量為30%時，土壤浸提液處理的枯草芽孢桿菌數量是清水處理的枯草芽孢桿菌的4倍。隨著YPG營養液比例的減少和勝紅薊土壤浸提液量的增加，在同一培養時段，枯草芽孢桿菌的數量在土壤浸提液的處理和清水處理之間的差距在縮小。由此可見，勝紅薊土壤浸提液具有促進枯草芽孢桿菌生長的作用，并且低濃度的土壤浸提液比高濃度的土壤浸提液對枯草芽孢桿菌的促進作用更加明顯。

2.2 勝紅薊土壤浸提液對石榴枯萎病菌生長的影響

勝紅薊根系分泌水土壤粗提物對石榴枯萎病菌的生長有細微促進作用（圖4），但10個時間段檢測點均未發現處理的菌餅直徑顯著高于對照的情況。對照病菌培養的12天內，菌餅生長速率呈直線增長，而用根系分泌水土壤粗提取物處理菌餅直徑總是稍高于對照處理。由此可見，勝紅薊根系分泌物土壤水提取液雖不對石榴枯萎病菌有抑制作用，但幾乎也沒有促進作用。與前人有關勝紅薊根系分泌物抑制土壤病原菌的生長的結果不一致[16]。也許，本試驗勝紅薊根系分泌物抑制作用不明顯與根系分泌物土壤浸提液濃度較低也有一定關系。

3 結論

前期研究結果發現，單獨利用生防菌枯草芽孢桿菌對防治石榴枯萎病幾乎沒有任何作用，栽培勝紅薊后枯草芽孢桿菌的防治效果大幅提升。為進一步探索這一現象的原因而進行了本次試驗。研究結果表明，根系分泌物是勝紅薊影響生防菌枯草芽孢桿菌防治石榴枯萎病效果的重要作用因子，其作用方式主要是通過促進枯草芽孢桿菌的定殖或增殖，增強枯草芽孢桿菌抑制石榴枯萎病的作用。未發現勝紅薊的根系分泌物對石榴枯萎病菌有直接的抑制作用。本研究結果對探索利用生物多樣性控制土傳病害的技術探索和機理研究具有一定的價值。

4 討論

利用微生物菌劑來控制有害生物危害，常被認為是克服化學農藥負面作用的一種綠色防控措施[17]。發達國家投入巨資研究如何提高生防菌劑的適應性、擴大生防菌劑的適用范圍和持效性[18-19]。但到目前為止，很少聽說一種菌劑像化學農藥那樣具有廣泛的適應性和活性。究其原因，微生物菌劑是活著的微生物，土壤環境的優劣決定著生防菌能否生存與發揮生防功能[20-21]。當周圍環境有利于生防菌定殖時，生防菌才能有效起到抑制土壤中病原菌的作用；當環境因子偏離微生物的承受范圍時，生防菌自身的生長就受到限制，根本不可能起到抑制土壤中病原菌生長的作用。因此，定殖環境的優良與否是生防菌發揮生防作用的關鍵[22]。

圖1 枯草芽孢桿菌在70%YPG培養液中的生長情況

圖2 枯草芽孢桿菌在50%YPG培養液中的生長情況

圖3 枯草芽孢桿菌在30%YPG培養液中的生長情況

圖4 勝紅薊土壤提取液對石榴枯萎病菌生長的作用

為了提高生防菌株的適應范圍，通常的方法是通過系列的篩選試驗甚至遺傳工程的手段培養適應各種環境的“超級菌”。但農業環境的多樣性，致使培養超級適應力的菌株異常困難，到目前為止市售的生防菌劑或多或少存在土壤條件的選擇性[23]。本研究將生防菌的使用與環境條件結合起來，應用生態學的觀點，從群落結構和功能的角度，通過增加植被多樣性來促進生態系統的物質與能量流動，促進微生物生態功能更好地發揮，在一定程度上不失為一種應用上的創新。

在考慮勝紅薊對土壤中有益菌是否具有促進作用的同時，筆者也考慮到其對土壤中病原菌是否存在抑制作用。許多菊科植物存在殺菌活性，具有抑制病原菌的作用。勝紅薊也被證明對柑橘園土傳病原菌具有抑制作用[24-25]。但本研究表明其對石榴枯萎病菌的作用不明顯。勝紅薊是南方農田果園比較常見的一種惡性雜草，這種雜草作為果園生態系統中的一個因子，對土壤環境的作用還需要從多學科角度不斷深入挖掘，以期揭示更多的生態規律。

[1]湯東生,蔣其軍,毛忠順,等.不同作物套栽對枯草芽孢桿菌控制石榴枯萎病效果的影響[J].中國生物防治學報,2012,28(2):88-94.

[2]劉亞柏,王敬根,付反生,等.果園生草栽培對土壤生態環境的影響[J].揚州大學學報:農業與生命科學版,2015,36(4):110-113.

[3]王耀鋒,邵玲玲,劉玉學,等.桃園生草對土壤有機碳及活性碳庫組分的影響[J].生態學報,2014,34(20):6002-6010.

[4]湯東生,蔣其軍,毛忠順,等.果園雜草對枯草芽孢桿菌控制石榴枯萎病的增效作用[J].植物保護,2012,38(3):72-76.

[5]Bais H P,Weir T L,Perry L G,et al.The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms[J].Annual Review of Plant Biology,2006,57:233-266.

[6]Larios L,Suding K N.Competition and soil resource environment alter plant-soil feedbacks for native and exotic grasses[J].AoB Plants,2015,7:1-9.

[7]Haichar F E Z,Santaella C,Heulin T,et al.Root exudates mediated interactions belowground[J].Soil Biology and Biochemistry,2014,77:69-80.

[8]Paul,E A.Soil microbiology,Ecology and Biochemistry(Fourth Edith)[M].New York:Elsevier,2014.

[9]Baetz U,Martinoia E.Root exudates:the hidden part of plant defense[J].Trends in Plant Science,2014,19(2):90-98.

[10]Huang X F,Chaparro J M,Reardon K F,et al.Rhizosphere interactions:root exudates,microbes,and microbial communities[J].Botany,2014,92(4):267-275.

[11]Hao W Y,Ren L X,Ran W,et al.Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants onFusarium oxysporumf.sp.niveum[J].Plant and Soil,2010,336(1):485-497.

[12]Zuo C,Li C,Li B,et al.The toxic mechanism and bioactive components of Chinese leek root exudates acting againstFusarium oxysporumf.sp.cubensetropical race 4[J].European Journal of Plant Pathology,2015,143(3):447-460.

[13]Fang Y,Zhang L,Jiao J,et al.Tobacco rotated with rapeseed for soil-borne phytophthora pathogen biocontrol:mediated by rapeseed root exudates[J].Front Microbiology,2016,7:894.

[14]Wang B,Li R,Ruan Y,et al.Pineapple-banana rotation reduced the amount ofFusarium oxysporummore than maize-banana rotation mainly through modulating fungal communities[J].Soil biology&Biochemistry,2015,86:77-86.

[15]Yuan J,Huang Q,Raza W,et al.Organic acids from root exudates ofbanana help rootcolonization ofPGPR strainBacillusamyloliquefaciens NJN-6[J].Scientific Reports,2015,5:13438.

[16]Kong C H,Liang W,Hu F,et al.Allelochemicals and their transformations in the Ageratum conyzoides intercropped citrus orchard soils[J].Plant and Soil,2004,264(1-2):149-157.

[17]Bruce,T J A,Smart L E,Birch A N E,et al.Crop Protection:Prospects for plant defense activators and biocontrol in IPMConcepts and lessons learnt so far[M].Elsevier,2016.

[18]陳源,卜元卿,單正軍.微生物農藥研發進展及各國管理現狀[J].農藥,2012,51(2):83-89.

[19]Ravensberg W J.Commercialisation of Microbes:Present Situation and Future Prospects,in Principles of Plant-Microbe Interactions[M].Springer International Publishing,2014:309-317.

[20]Hartmann A,Schmid M,van Tuinen D,et al.Plant-driven selection of microbes[J].Plant and Soil,2009,321(1):235-257.

[21]Morgan J A W,Bending G D,White P J.Biological costs and benefits to plant-microbe interactions in the rhizosphere[J].Journal of Experimental Botany,2005,417:1729-1739.

[22]van Veen J A,van Overbeek L S,van Elsas J D.Fate and activity of microorganisms introduced into soil[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,1997,61(2):121-135.

[23]Symondson W O C,Sunderland K D,Greenstone M H.Can generalist predators be effective biocontrol agents?[J].Annual Review of Entomology,2002,47:561-594.

[24]Kong C,Liang W,Hu F,et al.Allelochemicals and their transformations in theAgeratum conyzoidesintercropped citrus orchard soils[J].Plant and Soil,2004,264(1):149-157.

[25]胡飛,孔垂華,徐效華,等.勝紅薊黃酮類物質對柑桔園主要病原菌的抑制作用[J].應用生態學報,2002,13(9):1166-1168.