菌種保藏方法研究

鐘 杰，左澤彥

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽 550016)

現(xiàn)階段，越來越多的菌種被人們發(fā)現(xiàn)并運(yùn)用到食品、醫(yī)療、化工等各個(gè)領(lǐng)域。隨著對菌種的深入研究和運(yùn)用，人們逐漸發(fā)現(xiàn)菌種和現(xiàn)代人們的生活息息相關(guān)。為了使從自然界分離得到的優(yōu)質(zhì)菌株能夠得以持久利用，菌種的保藏方法必然成為研究的重點(diǎn)，這樣才能使具有優(yōu)質(zhì)性能的菌株最大程度的發(fā)揮作用，更為重要的是在菌種保藏過程中菌種原有的特性不會(huì)改變或改變很小，這對微生物的研究具有極大促進(jìn)作用。

世界各國非常重視微生物菌種的保藏工作。菌種保藏研究始于1890年，但直到1906 年，各國才相繼建立了菌種保藏機(jī)構(gòu)。相比，中國的菌種保藏機(jī)構(gòu)于20世紀(jì)50年代才開始建設(shè)， 直到1979 年正式成立6 個(gè)專業(yè)性保藏管理中心[1]。研究和選擇一種適宜的保藏方法成為各國學(xué)者研究的重要工作[2]。

1 菌種保藏的原理

菌種保藏的原理是根據(jù)菌種特有的生理生化特性，人為制造低溫、干燥、缺氧的環(huán)境使菌種保持原有的性狀不發(fā)生變異或變異很小，終止其繁殖，使代謝降到最低，從而達(dá)到半休眠，甚至是完全休眠的狀態(tài)。對菌種進(jìn)行保藏的最終目標(biāo)就是降低菌種的死亡、變異、污染，保持菌種的活性[3]。

2 常用的菌種保藏方法

2.1 定期移植法

定期移植也叫繼代保藏法，就是將菌種接種到適合生長的培養(yǎng)基上生長至成熟或產(chǎn)生孢子時(shí)，做好標(biāo)記和記錄，放置于低溫2～10℃，實(shí)驗(yàn)室通常放置于4℃冰箱進(jìn)行短期的菌種保藏。

定期移植法是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室使用最多的短期保藏菌種的方法。

2.2 甘油法

甘油法是在無菌環(huán)境中利用無菌生理鹽水將菌種制備成菌懸液，再用濃度為40%～50%甘油經(jīng)滅菌處理后作為保護(hù)劑，保護(hù)菌種在凍融過程中不破壞原生質(zhì)層和細(xì)胞膜，菌液和甘油等量加入到滅菌的離心管中，做好標(biāo)記和記錄，放置與-20℃冰箱或-80℃超低溫冰箱，可保藏3～5年，柳洪潔[4]對甘油保藏法進(jìn)行了改良，用滅菌的肉湯代替生理鹽水制備菌懸液，取得了更好的保藏效果。甘油保藏法是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行長期保存菌種的主要方法之一。雖然定期移植方法簡單，但需要經(jīng)常移植，移植的過程中會(huì)發(fā)生染菌、變異等問題，所以長期保藏菌種可采用甘油法。

2.3 干燥保藏法

干燥保藏法也叫載體保藏法，是利用各種方法將菌種吸附在載體上，將菌種用來生長繁殖的水分除去，使菌種代謝將至最低變?yōu)樾菝郀顟B(tài)，但又能保持菌種原有的特性。根據(jù)載體不同，干燥保藏法主要有沙土管保藏法、濾紙保藏法、明膠片保藏法、硅膠保藏法、麩皮保藏法等。其中沙土管保藏法、濾紙保藏法、明膠片保藏法使用最多，以下以沙土管保藏法說明。

取河沙與黃土經(jīng)過多次的過篩處理，用酸去除有機(jī)質(zhì)，然后用純化水沖洗至中性，烘干備用。按照沙與土3∶2的比例混合放在沙土管中，進(jìn)行2～3次的高溫滅菌，將要保藏的菌種或孢子放于沙土管中，用真空機(jī)抽干管內(nèi)的水分，放于4℃冰箱可保藏5～7年。

2.4 冷凍干燥保藏發(fā)

冷凍干燥也叫冷凍真空干燥保藏法。主要步驟是將菌種制成懸浮液，加入保護(hù)劑(如甘油)，在-45℃左右的低溫環(huán)境中快速冷凍，然后在真空減壓環(huán)境中使水分升華，從而營造一個(gè)不宜菌種生長而又能長期保藏的環(huán)境。

冷凍干燥保藏法是專業(yè)機(jī)構(gòu)保藏菌種使用最多的的方法。該種方法結(jié)合了多種保藏菌種的特點(diǎn)，將保藏環(huán)境控制在低溫、缺氧、干燥狀態(tài)，同時(shí)還添加保護(hù)劑減少了在保種對菌種的傷害，多重有利的環(huán)境因素抑制了菌種的生理活動(dòng)，使菌種處于休眠狀態(tài)，這種方法適用于絲狀真菌、細(xì)菌、放線菌、病毒等，保藏時(shí)間可達(dá)10～20年，甚至更久的時(shí)間。

2.5 液氮超低溫保藏法

液氮超低溫保藏法是將需要保藏的菌種和保護(hù)劑按一定的比例放于凍存管中，再將凍存管保藏在(-196～-150℃)的超低溫液氮中，常用的保護(hù)劑有甘油、血清蛋白、二甲基亞礬、聚乙烯氮戊環(huán)、糊精、吐溫80 等，不同的菌種要根據(jù)自己的特性選擇不同的保護(hù)劑。

液氮超低溫保藏法是國際上保藏菌種常用的方法，是目前保藏菌種最理想的方法。在超低溫環(huán)境中菌種喪失了代謝功能，保持了菌株原有的性狀，變異的可能性也大大降低，這種方法對大部分菌株都適用，且保存時(shí)間長達(dá)5～8年。

表1 常用菌種保藏方法優(yōu)缺點(diǎn)

3 菌種退化的原因及復(fù)壯措施

3.1 菌種退化

菌種在長期的保藏中受外界因素或自發(fā)突變造成菌種某些優(yōu)良性能的衰退，稱為菌種退化。菌種退化嚴(yán)重影響菌種的特性和質(zhì)量，了解和掌握菌種退化的原因和復(fù)壯措施是為了保持菌種的優(yōu)良性狀及生活力強(qiáng)的特性。

3.2 菌種退化的原因

導(dǎo)致菌種的退化的因素有很多，有自發(fā)突變，也有外界因素的影響。主要因素有遺傳物質(zhì)變異、基因突變、培養(yǎng)環(huán)境不適、保藏方法不當(dāng)、菌種混雜、病毒感染等等。

3.3 復(fù)壯措施

在長期的保藏過程中，菌種因多種因素的影響，變異和衰退的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，為了維持或恢復(fù)菌種原有的優(yōu)良性狀，通常都要給菌種進(jìn)行復(fù)壯處理。常用的菌種復(fù)壯的方法主要有菌種純化、更換適宜的培養(yǎng)基、菌絲尖端分離、控制菌種的傳代次數(shù)及采用適宜的保藏方法等。下面對各種復(fù)壯措施進(jìn)行介紹。

菌種純化：為了使菌種復(fù)壯，菌種純化是常用的一種復(fù)壯方法。原理是定期分離菌種，將退化的菌種分離出來，挑選出具有優(yōu)良性狀的菌株在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恢復(fù)菌種原有的生長發(fā)育，再而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)[5]。

更換適宜的培養(yǎng)基：菌種在培養(yǎng)過程中因?yàn)榇x物的增加，導(dǎo)致生長環(huán)境的改變，菌種長期處于不利環(huán)境時(shí)就會(huì)出現(xiàn)退化，更換適宜的培養(yǎng)基就有可能使菌種恢復(fù)原有的生長狀態(tài)。該方法是最簡單使菌種復(fù)壯的方法，但對很多退化的菌種不適合。

菌絲尖端分離：挑取健壯菌絲體頂端部分，進(jìn)行純化培養(yǎng)，以保持菌種的純度，使菌種恢復(fù)原來的生活力和優(yōu)良種性，達(dá)到復(fù)壯的目的[6]。

控制菌種的傳代次數(shù)：菌種在多次傳代過程中會(huì)發(fā)生少量基因的突變，到突變達(dá)到一定程度時(shí)，就會(huì)造成遺傳物質(zhì)的改變，然而頻繁無性繁殖一般都是負(fù)變異占絕對優(yōu)勢[7]。因此，控制菌種的傳代次數(shù)也是防止菌種退化和維持原有性狀的有效措施之一。

采用適宜的保藏方法：菌種在保藏過程中，由于方法不當(dāng)會(huì)使菌種生理、生化發(fā)生改變，導(dǎo)致代謝減弱或混亂，從而發(fā)生菌種退化。對于這種情況，采用合適的保藏方法將會(huì)使菌種再次恢復(fù)到原有狀態(tài)，使菌種復(fù)壯。

4 討論

由于菌種的特性不同及菌種保藏方法的優(yōu)缺點(diǎn)各異，因此，在選擇菌種保藏方法時(shí)應(yīng)充分考慮菌種的特性、保藏的目的、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施條件及經(jīng)濟(jì)效益，選擇最適宜的菌種保藏方法。選擇合理的菌種保藏方法，充分維持菌種的活性及純度，才能發(fā)揮菌種應(yīng)有的價(jià)值，提高科研的可信度，與此同時(shí)，掌握菌種退化的原因和復(fù)壯的措施，避免菌種在長期的保藏過程中丟失原有的優(yōu)良性狀。

[1]顧金剛,姜瑞波. 微生物資源保藏機(jī)構(gòu)的職能、作用與管理舉措分析[J].中國科技資源導(dǎo)刊,2008,40(5):53-57.

[2]穆 婷,封艷艷,宋 珉,等. 藥品微生物檢驗(yàn)用菌種保藏方法簡論[J]. 母嬰世界,2015,3(6):361-362.

[3]劉文麗,程 池,姚 粟,等. 韓國食品用微生物菌種管理現(xiàn)狀[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(11):237-242.

[4]柳洪潔. 動(dòng)物微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)菌種保藏與管理[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù),2014,12(3):26-28.

[5]赫朝燦.菌種退化的原因、處理措施及菌種保藏探析[J].生物技術(shù)世界,2015(2):1.

[6]佚 名.菌種保藏方法及復(fù)壯技術(shù)[J].吉林蔬菜,2017(6):34-35.

[7]李 紅,肖千明，劉 娜，等. 食用菌菌種退化原因分析及復(fù)壯方法的探討[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)2010(5)：57-59.

(本文文獻(xiàn)格式：鐘杰，左澤彥.菌種保藏方法研究[J].山東化工,2018,47(7):60-61.)