半胱氨酸保護基S-Phenylacetamidomethyl (Phacm)的合成及應用

黃 蓓，劉秀偉，袁 琳，羅迎娣，劉 毅

(河南省化工研究所有限責任公司，河南 鄭州 450052)

多肽固相合成中側鏈上半胱氨酸的巰基必須要預先被保護基保護起來，否則其高親核性的巰基將有可能在接肽過程中發生酰基化、烷基化等副反應[1]。

由半胱氨酸形成的二硫鍵在許多蛋白質和多肽中是一類非常重要的結構元素。來自不同物種的各種各樣的肽荷爾蒙、蛋白酶抑制劑、細胞激素和毒素都攜帶有此二硫鍵的結構元素，以便形成理想的三維結構以及賦予直鏈肽生物活性。為了使這些含有獨特二硫鍵結構的多肽和蛋白類物質能被作為潛在藥物候選者且最終真正應用到實際治療疾病過程中，大量的研究和優化工作已經開展[2]。

單個分子內的二硫鍵多肽分子的構建，常規的方法都是在反應最后一步溶液 中氧化相應的半胱氨酸的自由巰基。然而，當在多肽分子中構建多個二硫鍵時將會遇到一個巨大的挑戰，即如何能保證做到按照分子設計的那樣清晰明了地構建相應的二硫鍵，同時還可以高收率的得到目標產物。為了解決這個問題就需要在肽鏈合成中選擇合適的保護基對不同位點的半胱氨酸進行正交保護，通過不同的脫除條件來分步實現相應位點二硫鍵的構建，最終得到設計的目標產物[3]。

圖1 Phacm 保護基結構

傳統的半胱氨酸巰基保護基盡管可以構建大多數的多個二硫鍵，但是其相應的保護基脫除都需要在相對比較苛刻的化學條件下實現，如強酸、重金屬等。本文介紹了一種近年來發展起來的利用生物酶在非常溫和條件下就可以脫除的巰基保護基：S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)，Phacm 保護基結構如圖1所示[4]。

1 S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)介紹

S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)是一種半胱氨酸巰基保護基，此保護基可以兼容傳統的兩種多肽合成策略(Boc和Fmoc)。

Phacm與Acm在分子結構上有很大的相似性，因此這兩類保護基在化學性質上有一定的共通性，例如在標準的多肽合成過程中，這兩類保護基對相應的縮合劑和反應溶劑耐受性都很好。此外，Acm的脫除條件也可以被用于脫除Phacm。但另一方面這兩類保護基在化學性質上也表現出一定的差異性，例如Phacm可以被PGA生物酶在非常溫和的條件下脫除，而PGA生物酶對Acm就沒有任何的效果[5]。

2 Phacm保護的半胱氨酸衍生物合成方法

經典的Phacm保護的半胱氨酸衍生物合成過程包含這些步驟：1)苯乙腈酸性條件下水解得到相應苯乙酰胺；2)苯乙酰胺與甲醛在KOH，70℃條件下反應得到相應的胺基被羥甲基取代的N-(羥甲基)-2-苯乙酰胺；3)N-(羥甲基)-2-苯乙酰胺與L-半胱氨酸鹽酸鹽在三氟甲磺酸-三氟乙酸-水溶劑中，0℃條件下生成巰基被Phacm保護的半胱氨酸三氟甲磺酸鹽；4)Phacm保護的半胱氨酸三氟甲磺酸鹽再與二碳酸二叔丁酯(Boc2O)或者9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)反應最終得到氨基由Boc保護的S-Phacm半胱氨酸衍生物或者氨基由Fmoc保護的S-Phacm半胱氨酸衍生物[6]。Phacm 保護的半胱氨酸衍生物合成方法如圖2所示。

圖2 Phacm保護的半胱氨酸衍生物合成方法

3 Phacm保護基的脫除

為了得到活性目標分子，任何的保護基最終都要被脫除。Phacm作為巰基保護基也是如此，為了最終得到活性目標多肽分子，保護基Phacm也要最終被從分子結構中脫除。

以上介紹了Phacm保護基可以被PGA活性酶在非常溫和的條件下專一性的脫去，并且基本不會引起其它的副反應發生。近年來為了更方便地使用和回收PGA活性酶，已經發展了一種將PGA固載在高分子樹脂上的技術，這種固載的PGA活性酶不僅可以高效地脫除Phacm保護基，而且也可以很方便的回收，經多次利用后仍然具有高效的脫除活性[5]。

Phacm保護基被PGA活性酶脫除的機理：PGA活性酶可以在非常溫和的條件下專一性地脫除Phacm保護基骨架中的苯乙酰基并分解出苯乙酸，剩下的胺甲基保護的巰基進一步水解后，最終游離出含有自由巰基的半胱氨酸的活性肽[7]。PGA脫除Phacm保護基的機理如圖3所示。

圖3 PGA脫除Phacm保護基的機理

4 Phacm保護基的兼容性和應用

研究表明Phacm保護的半胱氨酸(Cys(Phacm))在兩種傳統的多肽固相合成策略中(Boc和Fmoc)在常用的肽鏈偶聯反應條件下，如DIEA-CH2Cl2(1∶19)、TFA- CH2Cl2(4∶6)、piperidine-DMF (2∶8)、0.1mol/L TBAF 的DMF溶液和DBU-DMF (1∶19)，室溫25℃反應24 h后仍然十分穩定，沒有發現任何的分解或者被脫除情況發生。

另外，研究也證明Phacm保護的半胱氨酸 (Cys(Phacm)) 在HF-Anisole 或 p-Cresol (9∶1) 0℃條件下反應1 h，以及TFA-Scavengers (Phenol,Ethane-1,2-dithiol,p-Cresol,Anisole) 室溫25℃反應2h，這兩種多肽合成策略中最后脫除全部保護基的條件下也是相對穩定的。同時，進一步地研究發現Phacm保護的半胱氨酸 (Cys(Phacm)) 即使在脫除巰基保護基Fm的條件下(Piperidine-DMF-β-mercaptoethanol (βME) = 10∶10∶0.7)也是非常穩定的[8]。

基于以上的研究數據顯示，巰基保護基Phacm可以在多肽合成中在脫除所有側鏈保護基的條件下保留下來，這就給下一步形成不同二硫鍵提供了一個很好的區位選擇可能性。

由于Phacm保護基這些獨特的性質，此保護基已經在尾加壓素類多肽(Urotensin-related peptide)和催產素類物質 (Oxytocin analogue) 等其他含有二硫鍵多肽類藥物的合成中取得了很好的效果[9]。

5 結論及展望

隨著新多肽藥物的發現和多肽技術的不斷更新，構建更加復雜多變的分子骨架的需求將會逐漸增加，這就相應的要求各種類型的保護基的發現與發展。近年來，隨著各個學科的不斷交叉融合，多肽藥物的合成也逐漸出現了與小分子、高分子、聚合物等物質結構和學科的融合，特別是對合成含有多個二硫鍵的多肽藥物，對半胱氨酸保護基的正交選擇尤為重要。因此尋找、發現、發展更加性質獨特或者廣譜性的半胱氨酸保護基也始終是多肽藥物合成研究的重點之一。

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(本文文獻格式：黃蓓，劉秀偉，袁琳，等.半胱氨酸保護基S-Phenylacetamidomethyl (Phacm)的合成及應用[J].山東化工,2018,47(7):51-53.)