DNA 甲基化參與LPS 誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α表達(dá)

安 冬， 王 軍， 劉紅羽， 燕曉曉， 呂文發(fā)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130118)

奶牛乳腺炎是我國(guó)乃至全世界內(nèi)影響奶牛業(yè)發(fā)展的一種重大疾病，對(duì)我國(guó)奶牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 病原菌是導(dǎo)致乳腺炎炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要因素之一，預(yù)防和治療奶牛乳腺炎并保障奶業(yè)食品安全現(xiàn)已經(jīng)成為奶牛業(yè)面臨的主要問(wèn)題。 因脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與病原菌感染的乳腺炎反應(yīng)十分相似，而被廣泛采用建立炎癥模型[1-3]。 近年來(lái)，有研究表明表觀遺傳學(xué)參與炎癥反應(yīng)[4-6]，DNA 甲基化是指不改變DNA 的序列，在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下DNA 分子上添加甲基，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種表觀遺傳調(diào)控，已有研究顯示，DNA 甲基化調(diào)節(jié)炎癥因子[7-9]。 IL-6、BNBD-5 和TNF-α 均參與多種炎癥反應(yīng)，且參與乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[10-12]。本試驗(yàn)選用Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)、ELISA 法檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)量，建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞的炎癥模型，隨后添加不同濃度的5-AZA，qRT-PCR 檢測(cè)TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平，明確DNA 甲基化是否參與LPS 誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α 的表達(dá)上調(diào)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 DMEM-F12 培養(yǎng)液和胎牛血清等購(gòu)自于GIBCO，5-AZA、DMSO、LPS、胰島素、皮質(zhì)醇等購(gòu)自于Sigma；反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR 試劑盒等購(gòu)于Takara；TRizol Reagent 購(gòu)自于Invitrogen；MTT 試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物公司；奶牛乳腺上皮細(xì)胞由王濤老師提供[13]。

1.2 炎癥模型建立 取鋪滿培養(yǎng)皿80%的傳代細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，用PBS 沖洗細(xì)胞3 遍，添加胰蛋白酶-EDTA 混合液；當(dāng)大部分細(xì)胞處于回縮變圓的狀態(tài)時(shí)，添加含有胎牛血清、雙抗、胰島素和皮質(zhì)醇的DMEM/F12 完全培養(yǎng)液中停止消化，使細(xì)胞再次懸浮，均分到新培養(yǎng)皿在37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)12 h 后，用0 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL 的LPS 分別處理細(xì)胞6 h、12 h、24 h后，收集細(xì)胞，檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α 表達(dá)。

1.3 5-AZA 處理檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)12 h，用0 μmol/L、1.0 μmol/L、2.5 μmol/L 和5.0 μmol/L 的5-AZA分別處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h，LPS 處理，收集細(xì)胞，檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α 表達(dá)。

1.4 qRT-PCR qRT-PCR 檢測(cè)炎癥因子的mRNA的表達(dá)量，比較炎癥因子的變化。

1.4.1 總RNA 提取 取出培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿，用預(yù)冷的PBS 沖洗培養(yǎng)皿底部3 次；采用Trizol 法提取總RNA，加入DEPC 水溶解，測(cè)定RNA 濃度及OD260/280 值。

1.4.2 RNA 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)Takara 公司PrimeScriptTMRT reagent Kit 說(shuō)明書(shū)，確定檢測(cè)的體系與程序進(jìn)行操作。

1.4.3 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，合成是由上海生工生物股份有限公司完成，信息見(jiàn)下表1。

1.4.4 qRT-PCR qRT-PCR 反應(yīng)由SYBR Green 熒光染料進(jìn)行，根據(jù)Takara 公司SYBRTMPremix Ex Taq TMⅡ(Tli RNaseH Plus)說(shuō)明書(shū)，確定檢測(cè)的體系與程序。 反應(yīng)體系與程序：dH2O 6 μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2 ×) 10 μL， 上下游引物0.8 μL，ROX Reference Dye II(50 ×) 0.4 μL，DNA 2 μL；95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，退火溫度，34 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s， 60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。 qRTPCR 反應(yīng)在qRT-PCR 儀中進(jìn)行， 得出結(jié)果由2 -△△Ct法進(jìn)一步分析。

表1 引物序列

1.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DMSO 或1.0 umol/L、2.5 umol/L 和5.0 umol/L 的5-AZA 處理，吸取上清液根據(jù)碧云天MTT 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；測(cè)定490/570nm OD 值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 通過(guò)SPSS 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異為P ＞0.05，差異顯著性為 P ＜0.05，差異極顯著為P ＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中IL-6、BNBD-5、TNF-α 的mRNA 的表達(dá)水平 結(jié)果如中插彩版圖1、圖2 和圖3 所示，1 μg/mL、10 μg/mL 和100 μg/mL 的LPS分別處理6 h、12 h、24 h 后，IL-6、BNBD-5、TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平相對(duì)于空白對(duì)照組均有所提高，其中1 μg/mL 的LPS 處理24 h 時(shí)，BNBD-5 的mRNA表達(dá)量變化無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，而IL-6 的mRNA 表達(dá)量變化差異顯著(P ＜0.05)，其余表達(dá)量變化均差異極顯著(P ＜ 0.01)。 當(dāng)1 μg/mL 的LPS 處理6 h 時(shí)，IL-6、BNBD-5、TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組均差異極顯著(P ＜0.01)。

2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TNF-α 的濃度 選用ELISA 法檢測(cè)LPS 處理對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞上清液中TNF-α 蛋白表達(dá)水平的影響。 結(jié)果如中插彩版圖4 所示，1 μg/mL、10 μg/mL 和100 μg/mL 的LPS 分別處理6 h、12 h、24 h，TNF-α 的蛋白水平相對(duì)于空白對(duì)照組均有所上升，且差異極顯著(P ＜0.01)。

2.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性 選用MTT 法檢測(cè)5-AZA 對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性影響。 結(jié)果如中插彩版圖5 所示，相對(duì)于對(duì)照組，添加DMSO 或者1.0 μmol/L、2.5 μmol/L 和5.0 μmol/L 的5-AZA對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)顯著影響，說(shuō)明5-AZA 的處理效應(yīng)不是因改變細(xì)胞活力導(dǎo)致。

2.4 5-AZA 對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平的影響 結(jié)果如中插彩版圖6 所示，相對(duì)于空白對(duì)照組TNF-α 的mRNA 表達(dá)量，DMSO處理組無(wú)顯著差異，LPS 處理組均出現(xiàn)極顯著差異；而用1.0 μmol/L、2.5 μmol/L 和5.0 umol/L的5-AZA 分別處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h，相對(duì)于空白對(duì)照組、DMSO 處理組和LPS 處理組，TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平均有顯著提高。

3 討論

近幾年廣泛應(yīng)用LPS 處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞建立炎癥模型，通過(guò)炎癥因子的表達(dá)量變化確定炎癥模型的建立。 本研究通過(guò)IL-6、BNBD-5 和TNF-α確立炎癥模型建立成功。 以往研究顯示，LPS 處理可誘導(dǎo)細(xì)胞IL-6、BNBD-5 和TNF-α 等炎癥因子表達(dá)上調(diào)[10]，但其機(jī)制目前尚不清楚。 本研究結(jié)果顯示，LPS 可上調(diào)牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α 表達(dá)，而經(jīng)DNA 甲基化抑制劑處理后，TNF-α 表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，表明DNA 甲基化參與LPS 誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α 表達(dá)上調(diào)。

有關(guān)研究表明，經(jīng)LPS 處理后，成纖維細(xì)胞的IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)量顯著上升[12]，乳腺上皮細(xì)胞的IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)量也顯著增加[10-11]。 這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，LPS 處理，可顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的IL-6、BNBD-5 和TNF-α 的mRNA 的表達(dá)量。 郭堯的研究發(fā)現(xiàn)[14]，1 ug/ml LPS處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞4h 或6h，TNF-α 的表達(dá)量顯著上升，與本試驗(yàn)相符。 LPS 濃度為1 ug/ml 、處理6 h 時(shí) IL-6、 BNBD-5、 TNF-α 表 達(dá) 量 均 極 顯著上升。

DNA 甲基化通常是兩種方式，一是聚集DNMT-1，在DNA 復(fù)制的過(guò)程中維持DNA 鏈甲基化，一是聚集DNMT-3a 和DNMT-3b，催化DNA 鏈甲基化[15]。 5-AZA 通過(guò)抑制DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制DNA 甲基化。 有研究表明DNA 甲基化參與人骨髓干細(xì)胞和人單核細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，且參與TNF-α 的表達(dá)上調(diào)[9，14]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。 本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化參與LPS 誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α 的表達(dá)，可能通過(guò)降低TNF-α 的甲基化水平提高LPS 誘導(dǎo)的基因表達(dá)量，也可能是對(duì)TNF-α 上游因子甲基化調(diào)控而提高其表達(dá)量，具體機(jī)制尚不可知，有待下一步深入研究。 有研究表明，DNA 甲基化并不參與LPS 誘導(dǎo)人腸上皮細(xì)胞IL-8 的表達(dá)，而是由組蛋白乙酰化調(diào)控[1]；亦或是組蛋白和DNA甲基化相互作用共同調(diào)節(jié)LPS 誘導(dǎo)人單核細(xì)胞TNF-α 的表達(dá)[16]。

結(jié)論：本研究結(jié)果表明，DNA 甲基化參與LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α 表達(dá)上調(diào)。