蘇丹紅I 對大鼠CYP1 A1、CYP2 E1 和CYP3 A1基因表達及ALT 和AST 活性的影響

單春蘭， 劉超英， 孫文匯， 富國文， 嚴玉霖， 高 洪

(1. 云南農業大學動物科技學院， 云南 昆明 650201 ；2. 云南農業大學動物醫學院， 云南 昆明 650201)

Sudan I 是人工合成的親脂性偶氮化合物，常用作工業染料。 Sudan I 可通過多種途徑進入生物體內，通過胃腸道微生物還原酶、肝臟及肝外組織微粒體和細胞質的細胞色素還原酶系(如細胞色素P450s)等進行代謝[1]。 體內能夠代謝成相應的胺類物質，可滲透機體血紅細胞，對許多器官和組織造成損傷，對機體具有致癌、致突變、致氧化損傷、皮膚過敏等毒性作用。 細胞色素P450s，是一種廣泛存在于生物體內含亞鐵血紅素的超家族蛋白酶，主要有CYP1、CYP2、CYP3 三個基因家族，是生物體內參與內源性化合物(激素、脂肪酸)和外源性化合物(藥物、前致癌物)生物轉化酶系的主要成員，并與腫瘤的發生密切相關。 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)在肝臟組織中含量最為豐富，主要存在于肝細胞的胞漿內，機體受損時可由肝細胞釋放入血液中，使血清中的這種酶活性升高。天冬氨酸氨基轉移酶(AST)主要存在于心肌中，但肝臟中含量也非常高，在肝細胞中，線粒體存在80%，包漿中存在20%。 ALT 和AST 均為非特異性細胞內功能酶，正常機體血清含量很低，當肝細胞受損時，肝細胞膜通透性增加，胞漿內的ALT、AST 釋放入血漿，致使血清ALT、AST 的活性升高[2]。

本試驗擬用空白對照組、Sudan I 處理組實驗動物SD 大鼠，建立肝臟病理性損傷的中毒動物模型，采用半定量RT-PCR 技術和酶成分分析探討CYP450 酶系基因表達以及ALT 和AST 的變化，對認識Sudan I 致肝損傷機理以及建立Sudan I 中毒病理性評價標準等方面提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蘇丹紅I (Sudan I )，購自國藥集團化學試劑有限公司；TRIZol 試劑、DEPC、 RT-PCR 試劑盒、SYBR-Green Supermix(BIO-RAD)，購自北京全式金生物技術有限公司；DL-2000 Marker，購自云科生物有限公司；Gold view (生物核酸染料)，購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要儀器 DANGERSJ-CJ-1F 型超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；Beckman 超速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)；UV755B 紫外可見分光光度計(上海分析儀器廠)； Eppendorf PCR儀(德國Eppendorf 公司)；熒光PCR 儀(美國Bio-Rad公司)；DYCP-31BN 電泳槽(北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad 公司)；FA1004N 型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.3 實驗動物分組與處理 30 只清潔級SD 大鼠，體重140 ～160 g/只，雌(無孕)雄不拘，由昆明醫學院實驗動物科提供。 臨床檢查確認健康后，單籠、顆粒飼料預飼養3 d，自由飲水采食，編號并隨機分為空白對照組(C 組)和Sudan I 處理組(I ， II， III和IV 組)，每組6 只。

將Sudan I 與飼料按一定比例充分混勻配制成顆粒飼料，分別以4 個不同劑量飼喂Sudan I 處理組：I 組(265 mg/kg·bw)、II 組(530 mg/kg·bw)、III 組(795 mg/kg·bw)和IV 組(975 mg/kg·bw)，連續飼喂10 d。 C 組飼以普通顆粒飼料，飼喂與處理組相同天數。

1.4 肝臟樣品的采集 末次給藥后，大鼠禁食12 h，處死大鼠后立即剖腹，用已干熱滅菌的鑷子、剪刀剪取150 mg 左右的肝臟分別裝入無菌的凍存管中，擰緊瓶蓋后立即放入液氮中速凍。 然后轉入-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍保存備用。

1.5 半定量PCR 檢測CYP 亞酶mRNA 的相對表達 本研究以CYC 為內參對照，檢測大鼠肝臟組織中CYP 主要亞型CYP 1A1，CYP 2E1，CYP 3A1 mRNA 表達相對量。 方法為取大鼠肝臟組織30 mg，液氮研磨組織塊，按常規TRIZol 法提取總RNA。 在核酸定量儀nanodrop 下測定吸光度OD 值，計算RNA 的濃度，RNA 的濃度(μg/μL) =OD260×OD500(核酸稀釋倍數) × (40/1 000)μg/μL。 以總RNA為模板，按照北京全式金生物技術有限公司cDNA試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。 半定量RT-PCR 反應加入2 μL cDNA，20 μL 反應體系是10 μL IQ SYBR Green Supermix、正、反義引物各0.5 μL、1.5 μL 的cDNA 摸板，補去離子水至20 μL。 反應條件：預變性94 ℃，3.5 min； 變性94 ℃，30 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共40 個循環；最后72 ℃，延伸10 min。用2-ΔΔCt 法計算實驗組與對照組各基因的相對表達量[3-4]。 半定量RT-PCR 擴增引物參照文獻[5]設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表1。

表1 引物及擴增片段長度

1.6 血液樣品的采集 分別按照實驗設定的劑量處理后處死大鼠，摘眼球采集2 mL 血液制備血清，用于ALT 和AST 檢測。

1.7 統計學分析 采用SPSS 統計軟件19.0 進行單因素方差分析( ANOVA) 和最小顯著差法(LSD)進行兩兩比較。

2 結果與分析

2.1 半定量分析CYP 1A1、CYP2 E1 和CYP 3A1基因的表達 CYP 1A1、CYP 2E1 和CYP 3A1 基因相對表達量結果，見表2。

從表2 可以看出，半定量RT-PCR 檢測到在C、I ，II， III 組和IV 組CYP 1A1 基因相對表達量分別為1.28、1.71、2.03、2.20 和2.08，表明不同的Sudan I處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)；在C、I ， II， III 組和IV 組CYP 2E1 基因表達量分別為1.13、1.16、1.55、1.49 和1.31，表明Sudan I 不同處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)；在C、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和Ⅳ組基因表達量分別為1.08、1.29、1.31、1.41 和1.40。 t 檢驗結果表明，Sudan I 不同處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)。 在一定劑量范圍內，CYP 1A1，CYP 2E1 和CYP 3A1 基因的表達量均隨劑量上升而增加。

表2 大鼠肝臟CYP 1A1、CYP 2E1 和CYP 3A1_____________________基因表達量

2.2 CYP1A1、CYP2E1 和CYP3A1 基因的RT-PCR擴增圖 目的基因RT-PCR 電泳產物擴增結果見圖1。

圖1 目的基因RT-PCR 電泳產物擴增結果

從圖3 可以看出，顯示與預期相符，良好的、無拖尾的目的基因條帶。

2.3 ALT、AST 活性的變化情況 大鼠血清中ALT、AST 活性的測定結果見表3。

從表3 可以看出，本試驗結果顯示，ALT 活性在C、I ， II， III 組和IV 組分別為48、70、75、97 和137。t 檢驗結果表明，Sudan I 處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)。 AST 活性在C、I ， II， III 組和IV組分別為106、155、198、409 和938。 t 檢驗結果表明，Sudan I 處理組顯著高于C 組(P ＜0.05，P ＜0.01)。 且在一定范圍內，隨著Sudan I 劑量的增加，ALT、AST 活性有明顯升高的趨勢。

表3 Sudan I 對大鼠血清中ALT、AST 活性的變化

3 討論

3.1 蘇丹紅I 對CYP1A1 基因表達的影響 CYP 1A1 可以將外源物質轉變為親電子化合物，該親電子化合物可攻擊細胞內的生物大分子，與DNA 或蛋白質形成加合物，最終引起P450 酶系所在的靶器官肝臟發生損傷[6]。 有研究發現，CYP 1A1 在許多癌癥發病學中發揮著一定作用，CYP 1A1 表達水平被認為是化學致癌作用的一種潛在指標。 CYP 1A1活性只有在某些誘導劑，如二噁英、多環芳烴、多氯聯苯等誘導后表達水平較高，其誘導機制與芳香烴受體有關，芳香烴受體可高度誘導增加CYP 1A1 基因的表達而增加CYP 1A1 的活性，生成環氧化合物攻擊大分子物質，導致肝臟的損傷[7]。

本研究通過半定量RT-PCR 法分析CYP 1A1基因表達情況結果顯示，CYP 1A1 基因在C 組和Sudan I 處理組均有表達，且二組定量方法的檢驗結果一致，均表明不同的SudanⅠ處理組顯著高于C組，且在一定劑量范圍內表現為上升趨勢。 但是在Ⅳ組表現為下降，分析認為機體本身是一個復雜的大系統，肝損傷時代謝調控可能發生了變化。 王婷等[9]將懷孕大鼠暴露于煙霧中，提取肝臟和胎盤總RNA，半定量RT-PCR 法分析肝臟和胎盤CYP 1A1基因的表達變化。 結果顯示，肝臟CYP 1A1 基因表達和胎盤CYP 1A1 基因表達均高于正常C 組，表明香煙中所含多環芳烴類物質及尼古丁等有毒物質增加對機體肝臟的損傷。 可見在代謝外源毒物過程中，CYP 1A1 處于重要位置。

3.2 蘇丹紅I 對CYP 2E1 基因表達的影響 CYP2家族細胞色素CYP 2E1 在體內負責6 大類、70 余種低分子化學物質的代謝，包括苯胺、乙醇、丙酮、氨基甲酸乙酯以及亞硝胺類化合物等[10]。 有些外源毒物可經CYP 2E1 代謝，代謝生成肝毒性的活性中間產物，導致了肝細胞的基因表達，啟動膜的脂質過氧化，導致胞內外的Ca2+濃度平衡狀態發生改變，破壞機體重要的抗氧化物質谷胱甘肽，從而引起肝臟細胞的損傷[11]。 采用半定量PCR 法分析CYP 2E1 基因的表達情況結果顯示，CYP 2E1 基因在C 組和Sudan I 處理組均有表達，Sudan I 不同處理組顯著高于C 組，且在一定劑量范圍內CYP 2E1基因的表達呈現為上升趨勢。 但在Ⅲ組表現為下降，分析認為機體本身是一個復雜的大系統，肝損傷時代謝調控可能發生了變化。 王愛紅等[12]將氯乙烯染毒大鼠，觀察肝CYP 2E1 活力和基因表達的影響，發現隨著氯乙烯染毒劑量的增加，大鼠肝臟中CYP2E1 活性和基因表達量也隨之增加，結果顯示了氯乙烯促使CYP2 E1 基因表達的增加，導致了肝細胞的基因表達，啟動膜的脂質過氧化，導致胞內外的Ca2+濃度平衡狀態發生改變，破壞機體重要的抗氧化物質谷胱甘肽，從而引起肝臟細胞的損傷。

3.3 蘇丹紅I 對CYP 3A1 基因表達的影響 CYP 3A1 是CY P450 基因家族中最重要的代謝酶基因，其在許多毒理學和藥物代謝方面具有重要意義[13]。CYP 3A1 在藥物代謝、環境中有害物質的代謝及內源性類固醇激素的代謝中，它是一種重要的單氧化酶，它能被多種化合物所誘導，也能被多種化合物所抑制。 這種酶的活性影響著外源物的血液濃度、代謝過程，從而對外源物的安全性和毒副作用產生影響。 有報道發現，如果CYP 3A1 活性被誘導增加，可導致生殖系統的毒性作用[14]。 采用半定量RT-PCR 法分析CYP 3A1 基因表達量情況，t 檢驗結果表明，Sudan I 不同處理組顯著高于C 組，且在一定劑量范圍內CYP 3A1 基因的表達呈現為上升趨勢。 但在Ⅳ組表現略有下降，分析認為機體本身是一個復雜的大系統，肝損傷時代謝調控可能發生了變化。 由此可見，CYP 3A1 誘導作用影響了Sudan I在血液濃度的代謝速度，對機體產生了影響，而發揮Sudan I 的毒性效應。

3.4 蘇丹紅Ⅰ對ALT 和AST 活性的影響 ALT、AST 是反映肝臟損傷的最重要的生化指標，ALT 在肝臟組織中含量最豐富，損傷時可由肝細胞釋放入血液中，使血清中的這種酶活性升高。 AST 主要存在于心肌中，但肝臟中含量也非常高，當肝細胞受損時，肝細胞膜通透性增加，胞漿內的ALT、AST 釋放入血漿，致使血清ALT、AST 的活性升高。

本試驗結果表明，Sudan I 處理組ALT、AST 活性顯著高于C 組，且隨著劑量的增加，兩者活性有明顯升高的趨勢。 谷長勤等[15]在黃曲霉毒素導致雛鴨中毒肝損傷的實驗報道中采用測定血清AST、ALT 水平來探討黃曲霉毒素對雛鴨中毒損傷程度。同樣本試驗也采用測定血清AST、Sudan I 對大鼠肝臟細胞損傷的程度。 通過結果，我們可以分析出當Sudan I 進入機體后，隨血液入肝臟后，致胞漿內轉氨酶釋放，故血清ALT 水平明顯升高，隨著時間的增加，肝細胞病變加劇，大量的肝細胞使線粒體內結合的AST 釋放，故血清內AST 活性也明顯升高，因而導致了機體肝臟損傷。