加米霉素注射液無菌檢查方法的試驗

趙梅仙， 宋 敏， 張國棟， 張傳良， 徐金雷， 葛辛玫， 馬佳穎， 王 楠

(中牧實業股份有限公司， 北京 海淀 100095)

加米霉素為氮雜內酯類的第二代大環內酯類抗生素，由梅里亞有限公司開發的獸用抗生素加米霉素注射液ZACTRAN，分別于2007 年、2010 年、2011 年，經由歐盟、加拿大和FDA 批準使用，對溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等病原體有很好的抑菌和殺菌作用，臨床可用于預防和治療由以上病原菌引起的牛呼吸道感染的疾病(BRD)[1-6]。 可以用于動物，具有吸收快、體內殘留低、體內分部廣、安全高效等優點，暫無不良反應報道。 為了保證藥品的質量和用藥安全，必須進行無菌控制。 本文根據《中國獸藥典》2015 年版一部附錄[7]、檢驗操作規程[8]、相關文獻[9-12]對加米霉素注射液的無菌檢查進行了實驗研究，建立了可靠的無菌檢查方法并進行了驗證。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 供試品 加米霉素注射液為中牧實業股份有限公司自制(批號：130307、130319、130403)，規格為100 mL。

1.1.2 試劑 聚山梨酯80，購自國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨，購自北京雅客生物科技有限公司。

1.1.3 培養基 胰酪大豆胨培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基，均購自北京雅客生物科技有限公司。

1.1.4 稀釋劑與沖洗液 0.1% 無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液為自配，滅菌后備用。

1.1.5 菌種 大腸埃希菌CMCC(B)44102、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、銅綠假單胞菌CMCC(B)10104、枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501、生孢梭菌CMCC(B)64941、白色念珠菌CMCC(F)98 001、黑曲霉CMCC(F)98003，均購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 儀器 HTY-2000A 集菌儀、全封閉無菌試驗過濾培養器(杭州高得泰林生物設備有限公司)。

2 方法

2.1 菌液制備

(1)取經35 ℃培養18 ～24 h 的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨培養基1 mL，以0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍稀釋至10-6～10-9約為10 ～100 CFU/mL 備用。

(2)取經35 ℃培養18 ～24 h 的生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養基1 mL，以0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍梯度稀釋至10-7備用。

(3)取經25 ℃培養24 h 的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，以0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍梯度稀釋至10-5～10-7約為10 ～100 CFU/mL 備用。

(4)接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，取經25 ℃培養7 d 的黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養物，加3 ～5 mL 含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，以0.05%(mL/mL)聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液10 倍梯度稀釋至10-5～10-7孢子數約為10 ～100 CFU/mL 的孢子懸液做活菌計數備用。

2.2 菌液計數 取上述菌液，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌液各1 mL加入培養皿，每種菌液做2 個平皿，注入胰酪大豆胨培養基35 ℃培養24 ～48 h；生孢梭菌1 mL 加入培養皿，菌液做2 個平皿，注入硫乙醇酸鹽流體培養基35 ℃培養24 ～48 h；取黑曲霉菌和白色念珠菌液各1 mL 加入培養皿，每種菌液做2 個平皿，注入沙氏葡萄糖液體培養基25 ℃培養48 ～72 h。 計數，取平均值。

2.3 培養基的靈敏度和無菌檢查

2.3.1 培養基的無菌檢查 取121 ℃、滅菌15 min的硫乙醇酸鹽流體培養基(12 mL/管)5 支，35 ℃恒溫培養14 d，取121 ℃、滅菌15 min 的胰酪大豆胨培養基(9 mL/管)5 支，25 ℃恒溫培養14 d。 試驗結果為無菌生長，表明培養基無菌性檢查合格。

2.3.2 培養基靈敏度檢查 取121 ℃、滅菌15 min的硫乙醇酸鹽流體培養基(12 mL/管)7 支，分別接種小于100 CFU 的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2 支，另一支不接種作為空白對照，35 ℃恒溫培養3 d；取121 ℃、滅菌15 min的胰酪大豆胨培養基(9 mL/管)7 支，分別接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉各2 支，另一支不接種作為空白對照，25 ℃恒溫培養5 d。

2.4 方法適用性試驗

2.4.1 沖洗量的確定 取本品適量，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進行稀釋，通過孔徑為0.45 μm 已被沖洗劑濕潤過的一次性全封閉集菌過濾培養器，分別用沖洗液300、500、700 mL 依次振搖沖洗，即每次100 mL，分別沖洗3 次、5 次、7 次，最后1 次沖洗液中加入相應的試驗菌，同法過濾，再加入相應的培養基100 mL，作為供試品管。 另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為菌液對照管。

另取1 次性全封閉集菌過濾培養器過濾0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液后，分別只加入100 mL 硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨培養基，不加對照菌液，作為該次試驗的陰性對照管。置相應溫度培養3 ～5 d。

2.4.2 檢查方法驗證 取本品適量，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進行稀釋，通過孔徑為0.45 μm 的已被沖洗劑濕潤過1 次性全封閉集菌培養器用沖洗液500 mL，分次振搖沖洗(每次100 mL)， 在最后1 次沖洗液中加入試驗菌，過濾。 加硫乙醇酸鹽流體培養基或胰酪大豆胨培養基100 mL，作為供試品管。 另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為陽性對照。 取試驗用薄膜過濾器，一濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養基100 mL，另一濾筒加入胰酪大豆胨培養基100 mL，分別作為相應的陰性對照。 分別置于30 ℃～35 ℃、20 ℃～25 ℃培養箱中培養3 d。逐日觀察結果。

2.5 供試品無菌檢查 取本品10 瓶，每瓶取10 mL，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進行稀釋，采用驗證過的無菌檢查方法對3 批加米霉素注射液進行無菌檢查，采用金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌，取試驗用薄膜過濾器，一濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養基100 mL，另一濾筒加入胰酪大豆胨培養基100 mL，分別作為相應的陰性對照，細菌培養30 ℃～35 ℃培養14 d，霉菌培養20 ℃～25 ℃培養14 d。

3 結果與分析

3.1 菌液計數 7 種菌液菌落的計數結果見表1。由表1 可知，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液稀釋到一定的濃度，菌落計數能達10 ～100 CFU/mL，符合要求，能作為試驗菌液。

表1 各驗證用菌液的稀釋度及菌落數

3.2 培養基靈敏度檢查 培養基靈敏度檢查見表2， 由表2 可知，各試驗菌株在硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨培養基中，經過特定的時間培養均生長良好，空白對照管無菌生長，表明該培養基對各試驗菌株的生長沒有影響，其靈敏度符合要求。

3.3 沖洗量的確定 逐日觀察結果，結果見表3。從表3 中可知，當沖洗量為300 mL 時，除加入金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的供試品管外，其余5 種菌在規定的條件下，供試品管與菌液對照管比較，均生長良好，說明該檢驗量的供試品在該檢驗條件下對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑菌作用，需要增加沖洗液的用量，去除抑菌成分。

表2 培養基靈敏度檢查試驗結果

表3 沖洗量驗證試驗結果

當沖洗量增加至500 mL 時，供試品管中各菌生長良好。 兩個陰性對照管均無微生物生長，兩種培養基均澄清透明。 因此確定本品的最佳沖洗量細菌檢查和真菌檢查均為500 mL。

3.4 檢查方法驗證結果 無菌檢查方法驗證結果見表4，由表4 可知，供試品各容器中試驗菌均生長良好，證明了供試品的該檢驗量在該試驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。

表4 檢查方法驗證結果

3.5 供試品無菌檢查 供試品的無菌檢查選擇金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌進行檢驗，其檢驗結果見表5。 從表5 可見，陽性對照菌72 h 內生長正常，陰性對照管、各供試品管無菌生長。

表5 供試品無菌檢查結果

4 討論

按《中國獸藥典》規定的無菌檢查法對加米霉素注射液進行了無菌方法研究，試驗選用薄膜過濾法，選擇金黃色葡萄球菌作陽性對照菌。 研究結果表明，加米霉素注射液在試驗菌液計數及所用培養基無菌性、靈敏度符合規定條件下，經沖洗量為500 mL后，該產品無抑菌和干擾作用。 三批樣品經檢查，符合無菌要求。 因此，確定加米霉素注射液的無菌檢查方法為：取本品10 瓶，每瓶取10 mL，每10 mL 供試品加0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液150 mL 進行稀釋，經薄膜過濾法處理，用0.1%無菌蛋白胨的0.1%聚山梨酯80 溶液分次沖洗(每膜不少于500 mL)，依法檢查，應符合規定。通過上述驗證所建立的方法可用于加米霉素注射液的無菌檢查，結果準確、可靠，同時，本試驗建立的無菌檢查方法對于同類注射液的無菌檢查有一定的指導意義。