新疆南疆規模羊場片形吸蟲的基因鑒定及分析

王 娜， 徐建平， 胡建軍， 崔 鑫， 張婉琪， 張瑩鈺， 徐 震

(1.塔里木大學動物科學學院 新疆生產建設兵團南疆動物疫病診斷與防控工程實驗室， 新疆 阿拉爾 843300 ；2.新疆生產建設兵團第二師畜牧獸醫工作站， 新疆 庫爾勒 841000 ；3.塔里木大學生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

片形吸蟲病是由片形吸蟲感染引起的人獸共患病。 肝片吸蟲寄生于食草哺乳動物和人的肝臟和膽管內，對肝臟造成機械性損傷，引起機體肝炎、膽管炎，導致全身中毒和營養障礙使機體發育不良甚至死亡的寄生蟲病。 片形吸蟲在我國有兩種：肝片形吸蟲(Fasciola hepatica) 和大片形吸蟲(F.gigantica)，屬于片形科(Fasciolidae)。 肝片形吸蟲呈世界性分布，在我國也是分布最廣泛、危害最嚴重的寄生蟲病之一，遍及全國31 個省市自治區，很多呈地區性流行；大片吸蟲主要分布于熱帶和亞熱帶地區，在我國多見于南方諸省、區[1]。 片形吸蟲在其慢性病程中使動物瘦弱，發育障礙，乳牛產奶量減少，毛、肉產量減少和質量下降，給畜牧業帶來巨大經濟損失。 人感染片形吸蟲可引起腹痛、發熱和黃疸等癥狀，嚴重者甚至危及生命。

傳統的分類學主要依據片形吸蟲成蟲的形態，結合生活史、流行病學等特征對蟲體進行分類鑒定，對于形態比較規則的蟲體鑒別比較有效。 而兩種片形吸蟲形態極其相似，且片形吸蟲種內個體差異較大，同一蟲種又因宿主的種類、宿主的反應的不同而不同，導致蟲體的形態極其不規則，這就使得利用傳統的分類學方法對識別一些親緣種及隱藏種有一些難度。 本研究以形態學鑒定為基礎，結合PCR 鑒定方法，從分子生物學分類角度來鑒定在形態上較難分辨其種類的片形吸蟲，為新疆片形吸蟲種類鑒定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2017 年春季，新疆南疆某規模化羊場羊群中出現部分羊逐漸消瘦，食欲減退，被毛粗亂、易脫落，黏膜蒼白。 該養殖場為舍飼管理，小尾寒羊與當地品種羊雜交繁殖方式。 經對3 只極度消瘦的羊只剖檢，肝臟表面發現有蟲體，肝組織受損，肝臟腫大，膽管增粗。 剝離肝臟中蟲體，保存備用。

1.2 主要試劑 E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(OMEGA Biotek Inc，Norcross，USA)、2 ×Taq PCR Master-Mix、DNA 凝膠回收試劑盒、TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 儀器 PCR 儀(TECHNE，TC -1500)，小型高速冷凍離心機(Centrifuge 5415R，Eppendorf 公司)；電泳儀(Thermal cycler Block，Thermo Fisher 公司)；凝集成像儀(Gel DocTM XR+，Bio-RAD 公司)。

1.4 參考株 文章中涉及的肝片形吸蟲、大片形吸蟲、中間型吸蟲的參考株均下載于NCBI 中Gen-Bank。

1.5 方法

1.5.1 片形吸蟲處理及DNA 提取 取保存的完整蟲體，PBS 反復沖洗，研磨、凍融并提取DNA，于-20 ℃保存備用。

1.5.2 引物 根據GenBank 參考序列，選取片形吸蟲第一內轉錄間隔區(First internal transcribed spacer， ITS-1)和第二內轉錄間隔區(second internal transcribed spacer， ITS-2)基因的特異性引物作為肝片形吸蟲基因分型的PCR 擴增引物[2]，2 對引物如下：ITS-1(forward：5′ -CCGTAGCCCAAATC -T-3′)和(reverse：5′-TGACTACCCCACGGA -3′)；ITS - 2(forward：5′ - ATGCACCCGGTCCT - 3′)和(reverse：5′-CATGACTTACCGAAC -3′)，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.3 PCR 反應擴增體系 ITS-1 引物的PCR 反應體系(50 μL)：2 ×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物ITS - 1F/ITS - 1R 各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL 混勻。 PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；ITS -2 引物的PCR 體系(50 μL)：2 ×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物ITS- 2F/ITS - 2R 各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O18 μL 混勻。 PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.4 PCR 產物純化回收 取PCR 擴增產物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒純化回收PCR 產物。 送北京金諾銳杰基因科技有限公司測序。

2. 結果與分析

2.1 形態學特征 解剖鏡下觀察，片形吸蟲背腹呈扁平，外觀呈樹葉狀，蟲體前端有一呈三角形的錐狀突，后端鈍圓，體表有小的皮棘。 口吸盤呈圓形，位于錐狀突前端。

2.2 PCR 擴增結果 以片形吸蟲ITS -1 引物、ITS-2 引物，經PCR 分別擴增出約360 bp、250 bp 大小的目的片段，與預期的目的片段大小相符(圖1)。

圖1 肝片形吸蟲PCR 鑒定

2.3 基因序列分析 以ITS-1 引物擴增的ITS-1 基因序列，測序后在NCBI 中BLAST 比對，顯示新疆南疆3 例片形吸蟲ITS-1 基因序列與大片吸蟲參考株ISEM V-966(法屬圭亞那/2004，負鼠，AJ628403.1)和FgGZB2(中國/2004，牛，AJ628425.1)核苷酸同源性達98.2%；與肝片形吸蟲參考株FhGSG2(中國甘肅/2004，山羊，AJ628431.1)和FhNJG3(中國江蘇/2004，山羊，AJ628432.1)核苷酸同源性達100%；與中間型吸 蟲 參 考 株 FgGZB3 (中 國 貴 州/2004， 牛，AJ628426.1)、 FhSCC19 ( 中 國 四 川/2004， 牛，AJ628427.1)、 FhHLJC4 (中 國 黑 龍 江/2004， 牛，AJ628428.1)、 FhNJG4 (中 國 江 蘇/2004， 山 羊，AJ628429.1)、 FhGSG3 (中 國 甘 肅/2004， 山 羊，AJ628430.1)核苷酸同源性達98.2%(圖2)。

圖2 片形吸蟲ITS-1 基因核苷酸同源性比較

圖3 ITS-1 基因序列構建的片形吸蟲系統進化樹

以ITS-2 引物擴增的3 例新疆南疆片形吸蟲ITS-2 基因序列與大片吸蟲參考株FgC3(伊朗/2011，牛， JF432073.1)、 Shillong (印 度/2014， 羊，KJ720002.1)核苷酸同源性分別達98.7%和98.4%；與肝片吸蟲參考株FhF4(中國云南/2011，奶牛，JF496717.1)、FhGZ(廣州/2016，人，KU555843.1)核苷酸同源性達99.7%；與中間型吸蟲參考株Khanh.Ct.1(越南/2009，牛，AB536917.1)、C -Bf104(埃及/2008，狷羚羊，AB553738.1)、FhHLJC10(中國/2011，JF708041.1)、Itanagar(印度/2014，人，KU720005.1)核苷酸同源性均達98.7%(圖4)。

圖4 片形吸蟲ITS-2 基因核苷酸同源性比較

圖5 ITS-2 基因序列構建的片形吸蟲系統進化樹

3 討論

新疆是我國5 大牧區之一，放牧羊寄生蟲病種類繁多，其中消化道寄生蟲對羊的危害嚴重，導致動物生產性能下降，飼料利用率降低，產品質量下降，嚴重困擾新疆養羊業的發展。 新疆部分地區吸蟲感染情況較為嚴重，井波等2008 年在新疆庫車縣開展的牛羊寄生蟲感染調查，發現牛肝片形吸蟲感染率為24.38%，大片形吸蟲感染率為35.74%；羊肝片形吸蟲感染率為76.04%[3]。

目前普遍認為自然界可能存在3 種不同的種類：肝片形吸蟲、大片形吸蟲和介于二者之間的“中間型”。 歐洲、美洲、澳洲地區只存在肝片形吸蟲，而非洲和亞洲地區存在肝片形吸蟲和大片形吸蟲[4]。 因此，多年來，非洲和亞洲地區片形吸蟲的種類鑒定一直存在很多爭議[5]。 有學者認為除了有肝片形吸蟲和大片形吸蟲外，還可能存在片形吸蟲的“中間型”[6-7]。 黃維義(2002 年)等[8]鑒定出我國黑龍江的片形吸蟲有基因雜和型，認為是“中間型”的片形吸蟲。

一些學者研究表明，ITS -1 序列可作為線蟲、吸蟲、原蟲、昆蟲等寄生蟲分類鑒定的遺傳標記。核糖體DNA 的ITS -1 基因、ITS -2 基因作為片形吸蟲種類鑒定的遺傳標記，其進化速度比較快，用于低級分類階元或近緣種的系統發育研究具有獨特的優勢[2]。 董世娟(2004)[9]建立的特異PCR 方法，初步認為ITS-1 序列可作為遺傳標記來區分大片形吸蟲和肝片形吸蟲，同時也證實在我國除了此兩種片形吸蟲外，還可能存在著“中間型”的片形吸蟲。

本試驗通過片形吸蟲ITS -1 基因核苷酸同源性比較分析，發現新疆南疆3 例片形吸蟲ITS -1 基因型與大片形吸蟲核苷酸同源性為98.2%，與肝片形吸蟲核苷酸同源性為100%，與中間型吸蟲核苷酸同源性為98.2%；ITS-2 基因型與大片形吸蟲核苷酸同源性為98.7%，與肝片形吸蟲核苷酸同源性為99.7%，與中間型吸蟲核苷酸同源性為98.7%。通過ITS-1 基因、ITS -2 基因核苷酸同源性比較、系統進化樹分析說明，本研究中的新疆南疆3 例片形吸蟲為肝片形吸蟲，證實新疆南疆某羊場存在肝片形吸蟲的感染。 在感染時間、地理分布等方面，新疆南疆某羊場感染的肝片形吸蟲與參考株FhGSG2(中國甘肅/2004，山羊，AJ628431.1)、Fh-NJG3(中國江蘇/2004，山羊，AJ628432.1)、FhF4(中國云南/2011，奶牛，JF496717.1)、FhGZ(中國廣州/2016，人，KU555843.1)相比較，它們都具有相同的遺傳進化起源。

本試驗采用分子生物學技術，特異性ITS -1 和ITS-2 基因序列引物進行鑒定片形吸蟲，傳統形態學鑒定與靈敏、特異的的基因分類相結合，在一定程度上克服了形態學鑒定的局限性和主觀性，為新疆的片形吸蟲種類鑒定提供了科學的參考依據。