大腸桿菌表達(dá)腐敗梭菌α毒素及其產(chǎn)物的生物學(xué)特性鑒定

彭國(guó)瑞， 彭小兵， 李旭妮， 董令贏， 蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京 海淀 100081)

腐敗梭菌(Clostridium septium)是一種革蘭陽(yáng)性厭氧桿菌，可引起多種動(dòng)物的惡性水腫、肌肉壞死、氣性壞疽以及壞死性腸炎等疾病。 該菌能夠產(chǎn)生α、β、γ 和δ 4 種外毒素，其中α 毒素是其主要的致死性毒力因子，具有細(xì)胞毒性、壞死、溶血和致死性等特性。 對(duì)α 毒素結(jié)構(gòu)與功能[1]、致病機(jī)制[2-4]以及作為類毒素疫苗[5]的應(yīng)用等方面一直是國(guó)外學(xué)者研究熱點(diǎn)。 本試驗(yàn)通過(guò)大腸桿菌表達(dá)重組α 毒素，對(duì)產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行研究，以期為α 毒素的結(jié)構(gòu)功能、免疫原性、基因突變和疫苗研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 E.coli BL21(DE3)，購(gòu)自北京康為生物有限公司；腐敗梭菌C55-1 株(CVCC60021)、pET-32a( +)載體、Vero 細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 血清與抗體 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG，購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清白蛋白(BSA)，購(gòu)自Life Technologies 公司；腐敗梭菌天然外毒素(小鼠致死毒力200 MLD/mL)、抗毒素(中和效價(jià)550 MLD/mL)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 試劑 Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和SalⅠ等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；T4 DNA 連接酶，購(gòu)自NEB 公司；酶標(biāo)二抗顯色試劑盒，購(gòu)自Vector 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純或試劑純。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重16 ～18 g ICR 小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.5 α 毒素基因的擴(kuò)增

1.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中登錄的腐敗梭菌α 毒素序列(AY829447)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增α 毒素的完整基因csa。 上游引物：5′-CCGATGTCAAAAAAATCTTTTGCT-3′，下 游 引 物：5′-GGCTA ATTAATATCAATTTTTTTA- 3′，分別引入EcoR I 和SalⅠ酶切位點(diǎn)識(shí)別序列(下劃線部分)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 PCR 擴(kuò)增 25 μL 反應(yīng)體系：10 ×PCR 緩沖液2.5 μL，dNTP 2.0 μL，20 pmol/μL 上下游引物各0.5 μL，腐敗梭菌C55-1 株基因組模板1.0 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 18 μL。 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃1 min，50 ℃1 min，72 ℃1.5 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6 pET32a-csa 的構(gòu)建與鑒定EcoR I、SalⅠ雙酶切α 毒素基因PCR 回收產(chǎn)物和pET32a( +)載體，片段回收后，16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp + LB 平板。 挑取生長(zhǎng)良好的菌落PCR 和雙酶切鑒定；同時(shí)送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，獲得的序列與GenBank 中登錄的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.7 腐敗梭菌α 毒素基因的表達(dá)

1.7.1 重組E. coli BL21(pET32a-csa)的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定合格的E. coli BL21 (pET32a-csa)接種Amp+LB 肉湯，37 ℃200 r/min 震蕩培養(yǎng)到菌液OD600值至0.80 ～1.00，加IPTG 至終濃度1.0 mmol/L誘導(dǎo)4 h，以同樣的方法誘導(dǎo)E.coli BL21 (pET32a)。

1.7.2 重組α 毒素表達(dá)形式的確定 離心收集復(fù)溶誘導(dǎo)后的重組菌，冰浴超聲波破碎菌，功率100 w，每次4 s，間隔5 s，共20 次。 超聲裂解后12 000 r/min(4 ℃)離心1 mim，收集上清和沉淀。

1.8 重組α 毒素的生物學(xué)特性鑒定

1.8.1 Western-Blot 分析 誘導(dǎo)后的重組菌SDSPAGE 結(jié)束后電轉(zhuǎn)印PVDF 膜，以腐敗梭菌抗毒素作為一抗，HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG 為二抗檢測(cè)。

1.8.2 溶血性試驗(yàn) 1.0%綿羊紅細(xì)胞懸液中分別加入PBS 和蒸餾水作為陰陽(yáng)性對(duì)照，其他依次加入重組菌菌液離心上清、超聲波破碎沉淀、超聲波破碎上清、天然毒素、厭氣肉肝湯、LB 肉湯輕輕混勻，立即置37 ℃溫育，觀察并記錄各管的溶血情況。 開(kāi)始每隔15 min 觀察1 次，1 h 后，每隔1 h 觀察1 次，觀察3 h。

1.8.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 濃度為0.8 ×105～1.5 ×105Vero 細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞[6]，吸棄細(xì)胞生長(zhǎng)液，加入誘導(dǎo)后經(jīng)過(guò)濾除菌E.coli BL21(pET32acsa)的超聲波破碎上清和天然毒素稀釋液，37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育5 d，觀察細(xì)胞病變。

1.8.4 小鼠致死毒性試驗(yàn) 誘導(dǎo)后E. coli BL21(pET32a-csa) 菌液0.20 mL/只，腹腔注射小鼠2只，重組菌菌液離心上清、超聲波破碎上清、超聲波破碎沉淀懸浮液以及天然毒素0.20 mL/只，尾靜脈注射小鼠各2 只。 同時(shí)設(shè)E. coli BL21(pET32a)對(duì)照、PBS 和LB 培養(yǎng)基對(duì)照，觀察72 h。

1.8.5 毒力測(cè)定 用明膠緩沖液將誘導(dǎo)后的E. coli BL21(pET32a-csa)菌液離心上清、超聲波破碎沉淀以及超聲波破碎上清進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度0.20 mL/只，尾靜脈注射小鼠各2 只，觀察72 h。

1.8.6 血清中和試驗(yàn) 誘導(dǎo)后E.coli BL21(pET32acsa)的菌液離心上清、超聲波破碎上清、超聲波破碎沉淀和天然毒素用明膠緩沖液稀釋至15 MLD/mL，取0.60 mL 分別加入0.30 mL 腐敗梭菌抗毒素血清混合，37 ℃作用40 min，0.30 mL/只，尾靜脈注射小鼠各2 只，對(duì)照組0.2 mL/只，尾靜脈注射，觀察72 h。

2 結(jié)果

2.1 α 毒素基因的擴(kuò)增 以腐敗梭菌C55-1 株基因組為模板，PCR 擴(kuò)增出大小約1 300 bp 片段與預(yù)期大小相符。

2.2 重組表達(dá)載體pET32a-csa 的鑒定 重組質(zhì)粒pET32a-csa 經(jīng)PCR 和雙酶切鑒定，均得到大小約1 300 bp 的片段。 測(cè)序結(jié)果表明，插入片段與預(yù)期設(shè)計(jì)吻合，閱讀框完整正確，長(zhǎng)度為1 323 bp，序列與GenBank 已公布的腐敗梭菌α 毒素基因序列AY829447 相似度達(dá)到100%。

2.3 重組α 毒素的誘導(dǎo)表達(dá) 圖1 所示，在大小約67 kDa 處見(jiàn)特異蛋白條帶，與預(yù)期重組α 毒素分子量相符，表明E. coli BL21 (pET32a-csa) 誘導(dǎo)表達(dá)出重組α 毒素，包涵體形式為主，少部分以可溶形式表達(dá)。

2.4 重組α 毒素的生物學(xué)特性鑒定

2.4.1 Western-Blot 檢測(cè) 圖1 所示，表達(dá)產(chǎn)物能夠與腐敗梭菌抗毒素血清反應(yīng)，說(shuō)明經(jīng)重組α 毒素具有反應(yīng)原性。

2.4.2 溶血試驗(yàn) 表1 所示，加入天然毒素后紅細(xì)胞立即發(fā)生完全溶血，各類型重組α 毒素均沒(méi)有發(fā)生溶血。

2.4.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 加入E. coli BL21(pET32a)超聲波破碎上清、LB 肉湯、厭氣肉肝湯和PBS 對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)良好；隨著試驗(yàn)組超聲波破碎上清和天然毒素的梯度稀釋，細(xì)胞的病變程度隨之減弱；當(dāng)兩種毒素稀釋至104時(shí)，細(xì)胞幾乎不會(huì)發(fā)生病變，表明重組α 毒素具有細(xì)胞毒性。

2.4.4 小鼠致死毒性試驗(yàn) 如表2，注射了誘導(dǎo)后的重組E. coli BL21 (pET32a-csa)菌液、菌液離心上清、超聲波破碎上清和超聲波破碎沉淀以及天然毒素的小鼠均在24 h 內(nèi)死亡，其中天然毒素和超聲波破碎上清小鼠給藥1 h 內(nèi)即發(fā)生死亡，而且所有死亡小鼠均表現(xiàn)出與注射天然毒素后相同的失明、后肢麻痹等中毒癥狀。 注射E. coli BL21(pET32a)各形式以及PBS 和LB 對(duì)照組的小鼠均健活。

表1 不同形式α 毒素的溶血的試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同形式的重組α 毒素的毒性

表3 重組α 毒素的血清中和試驗(yàn)結(jié)果

2.4.5 毒力測(cè)定 超聲波破碎上清毒力最強(qiáng)為300 MLD/mL，菌液離心上清和超聲波破碎沉淀毒力相對(duì)較弱，見(jiàn)表2。

2.4.6 毒性中和試驗(yàn) 如表3 所示，用腐敗梭菌抗毒素中和天然毒素和重組α 毒素注射小鼠，小鼠均存活，注射了沒(méi)有進(jìn)行中和反應(yīng)的各形式毒素小鼠均發(fā)生了死亡，證明重組α 毒素的毒性可以被腐敗梭菌抗毒素中和。

3 分析與討論

Imagawa T 等用pUC19 載體通過(guò)大腸桿菌表達(dá)的腐敗梭菌α 毒素，除具有小鼠致死毒性外，對(duì)于人紅細(xì)胞還具有極強(qiáng)的溶血活性[7]，本試驗(yàn)證實(shí)了重組α 毒素具有細(xì)胞毒性和小鼠致死毒性但沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血活性，并進(jìn)一步測(cè)定了毒力，驗(yàn)證了其與抗毒素血清的相互作用。 結(jié)果表明，重組α 毒素具備類似于天然毒素的生物活性。分析原因，一方面重組α 毒素在結(jié)構(gòu)上能夠保持天然毒素的受體結(jié)合位點(diǎn)、功能活性位點(diǎn)和抗原表位；另一方面，根據(jù)天然毒素前體需要胰蛋白酶的裂解活化的特點(diǎn)[8]，推知宿主菌大腸桿菌產(chǎn)生了胰蛋白酶類對(duì)表達(dá)產(chǎn)物起到了活化作用。 此外，不同形式的重組毒素毒力存在的差異，說(shuō)明可溶表達(dá)形式的重組α 毒素能夠形成更加有利于功能發(fā)揮的空間構(gòu)象。

在應(yīng)用研究方面，α 毒素可以用于與疾病相關(guān)糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白的結(jié)合[9]、血紅蛋白尿的診斷[10]以及預(yù)防腐敗梭菌的疫苗。 特別是在疫苗的應(yīng)用研究方面，將腐敗梭菌外毒素制成類毒素疫苗在美國(guó)已有廣泛的應(yīng)用，彭小兵[11]等研究表明，外毒素毒力在一定范圍內(nèi)與類毒素疫苗的免疫效果成正相關(guān)，而我國(guó)制造滅活菌苗常采用胰酶消化湯培養(yǎng)腐敗梭菌，產(chǎn)生外毒素毒力有限，一般是100 ～200 MLD/mL[12]。 許多研究表明，用純化后的α 毒素具有很好的免疫原性，能夠使免疫機(jī)體抵抗不同血清型的腐敗梭菌及其孢子的攻擊[5、13]。 因此，獲得毒力更強(qiáng)的α 毒素制成類毒素疫苗成為進(jìn)一步提高腐敗梭菌疫苗免疫效果的有效途徑。 生物工程技術(shù)生產(chǎn)疫苗具有工藝簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、安全性高、易于規(guī)模化發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。 張燕[14]等以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型證明了重組α 毒素具有免疫原性，Lancto C A[15]等用無(wú)細(xì)胞毒性的重組α 毒素免疫火雞獲得了對(duì)腐敗梭菌的抵抗力。本試驗(yàn)制備的重組毒素含量高、毒力較強(qiáng)可達(dá)到300 MLD/mL。 由此可見(jiàn)，將重組α 毒素制成基因工程疫苗用于腐敗梭菌病的免疫預(yù)防。 綜上，利用原核表達(dá)系統(tǒng)可以制備出具有生物活性的重組腐敗梭菌α 毒素，為有關(guān)α 毒素的結(jié)構(gòu)功能、致病機(jī)制以及在生物技術(shù)等方面的應(yīng)用研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。