小反芻獸疫檢測技術研究進展

李園麗， 李 林， 樊曉旭， 吳曉東， 王志亮， 潘樹德

(1.沈陽農業大學 畜牧獸醫學院， 遼寧 沈陽 110866 ；2.中國動物衛生與流行病學中心 國家外來動物疫病研究中心， 山東 青島 266032)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊和綿羊。 該病一年四季均可發生，易感羊群的發病率和死亡率最高可達90%以上。 PPR 于1942 年首次報道以來[1]，在非洲的大部分國家，中東、南亞以及包括中國在內的部分亞洲國家都形成地方性流行，直接制約著養羊業發展和羊肉的有效供給，對食品安全和人類健康構成嚴重威脅。 世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告的疫病，各國無疫狀態需經OIE 官方認證。 我國農業部將其列為一類動物疫病，《國家中長期動物疫病防治規劃(2012—2020 年)》將其列為重點防范的13 種外來動物疫病之一。 在早期的實驗室診斷中，主要依靠瓊脂凝膠免疫擴散(AGID)、對流免疫電泳(CIE)和免疫捕獲ELISA 等常規技術，這些技術大多費時費力，靈敏度不高，不能特異性的鑒別診斷PPR。 隨著技術的不斷進步，PCR、Real-time PCR、重組酶聚合酶技術(Recombinase polymerase amplification，RPA)和多種ELISA 方法等高靈敏度、高特異性和高通量的檢測技術不斷應用于PPR 的檢測，為該病的控制和消滅提供了有利條件。

1 病毒的分離培養

病毒的分離培養通常采集病畜的眼結膜、鼻腔、口腔及回腸、直腸黏膜等部位的分泌物棉拭子，或者采集血液標本，也可剖檢采集淋巴結、扁桃腺、脾、肺、大腸等組織塊，然后用原代綿羊或者山羊胎腎細胞、新生羊睪丸細胞或非洲綠猴腎(Vero)細胞對病毒進行分離培養。 PPRV 接種細胞后的5 ～6 d會產生細胞病變(CPE)，其特點是出現多核細胞，有的出現核內包涵體，部分細胞形成空泡[2]。 2006 年Sreenivasa 等研究發現，利用E -B 病毒改造過的狨猴B 淋巴細胞衍生系MarmosetB95a 細胞更利于PPRV 的繁殖和分離。 隨后由猴源CV1 細胞改造的CHS-20 細胞系也被開發出來，能夠高效分離病原樣品中的PPRV，能穩定表達山羊SLAM 蛋白[3]。使用該方法鑒定比較準確，但費時費力、操作繁瑣，需要專業的細胞培養設備，不能作為常規的診斷方法。

2 病毒抗原檢測

在早期的PPRV 臨床診斷和剖檢過程中，瓊脂凝膠免疫擴散(AGID)和對流免疫電泳(CIE)被廣泛應用。 AGID 操作簡單，其成本低，不需要昂貴的儀器，對實驗環境要求不高，24 h 內可獲得結果，在野外和一般的實驗室均能操作。 CIE 是最快的病毒抗原檢測方法，與AGID 相比較，CIE 明顯提高了診斷速度，并且具有較高的敏感性，可作為PPRV 臨床檢測的篩選試驗方法。 但CIE 特異性較差，不能有效區分牛瘟病毒(RPV)和PPRV[4]。

當PPRV 抗原含量較低時，上述兩種方法不易將抗原檢測出來，而且所需時間相對較長。 因此需要更靈敏的方法所替代。

基于N 蛋白的單克隆抗體建立的免疫捕獲ELISA 具有較高的靈敏性和特異性，在室溫存放一周的感染細胞上清液中的N 蛋白仍能被檢測出來[5]。 該方法能夠有效檢測PPRV，適合田間樣品的常規檢測。 同樣是基于N 蛋白單克隆抗體建立的夾心ELISA(s-ELISA)檢測方法，也具有較高的靈敏性和特異性，與Vero 細胞病毒分離相比，s -ELISA 具有更高的靈敏性(71. 9%比65. 2%；P ＜0.05)。 與免疫捕獲ELISA 相比，這種s -ELISA 的靈敏度和特異性分別為88.9%和92.8%，比較適用于田間檢測[6]。

此外，基于抗PPRV 的M 蛋白和N 蛋白的單克隆抗體建立的斑點ELISA(dot -ELISA)，10 min 即可用肉眼直接觀察檢測結果。 與s -ELISA 方法相比，該方法的靈敏性和特異性分別為82. 5% 和91%[7]。 該方法在大規模的野外或現場流行病學調查過程中，能夠高效的篩選出可能感染PPRV 的臨床樣品。

表1 PPRV 抗原和抗體檢測方法

3 病毒核酸檢測

隨著分子生物學技術的發展，建立了一系列針對病毒核酸進行檢測的方法(表2)。 這些方法簡便快捷，具有較高的靈敏度和特異性，能夠進行高通量檢測，其中以RT-PCR 方法應用最為廣泛。

3.1 RT -PCR 和實時熒光RT -PCR Forsyth 等針對PPRV 的F 基因首次建立了RT -PCR 的檢測方法[8]。 隨后，針對N 基因建立的RT -PCR 方法是常規病毒滴定法的1 000 倍[9]。 但該方法屬于兩步法RT-PCR，逆轉錄和PCR 反應分別在不同的管子中進行，在樣品轉移過程中易造成污染而呈現假陽性。 隨后，對兩步法RT -PCR 進行改進，建立了更精準的一步法多重RT -PCR[10]。 利用單管同時擴增，當樣品為PPRV 陽性時可同時擴增出N 基因上的一個337 bp 片段和M 基因上的一個191 bp 片段，當RPV 為陽性時只能擴增出N 基因的337 bp片段，由于片段的差異，可以通過1.5%瓊脂凝膠電泳或酶切進行區分。 該方法可檢測到100 fg 的PPRVRNA。 與夾心ELISA 相比，一步法多重RT -PCR 能夠在臨床樣品中對PPRV 和RPV 進行快速鑒別診斷，提高了檢測靈敏度，降低了假陽性。 與兩步法RT-PCR 相比，一步法所有反應都在單管內完成，從而簡化了操作步驟，減少了污染。

無論是一步RT-PCR 還是兩步RT-PCR 的靈敏度和特異性都較高，而且所需時間也相對較短，但是其工作量較大，PCR 產物需經凝膠電泳拍照，存在較高污染的可能性等缺點，不適合PPR 的高通量檢測。 近年來，隨著分子生物學的發展，針對PPRV 的N 基因和M 基因設計的SYBR Green 和TaqMan 探針建立了Real time RT -PCR[11-13]。 該方法可以在一個封閉的系統中完成病毒RNA 的反轉錄、擴增和分析的過程，避免了普通RT -PCR 的污染問題。 該方法不僅可以進行病毒的定性分析，還可以對模板RNA 進行定量，具有高度的敏感性和特異性。 其自動化程度較高，提高了檢測效率。 實時熒光RT-PCR 具有較高的特異性、靈敏度、可重復性和擴增效率，在常規檢測中廣泛應用。

3.2 RT-PCR-ELISA RT-PCR-ELISA 是將RT-PCR 和夾心ELISA 相結合，基于PPRV 的N 基因建立的檢測方法[14]。 該方法先通過RT -PCR 產生一個用地高辛標記的336 bp 擴增產物，然后再用ELISA 方法進行檢測擴增產物。 該方法可檢測PPRV的早期和晚期病毒，比傳統的瓊脂糖凝膠電泳分析的RT-PCR 方法靈敏10 000 倍。 在臨床試驗中，該方法與傳統的夾心ELISA 方法相比，陽性率分別為66.2%和48.6%，同時可以鑒別診斷PPRV 和RPV。

3.3 RT-LAMP 基于PPRV 的M 基因和N 基因建立了RT -LIMP 檢測方法[15-16]。 該方法在恒溫條件下，通過BstDNA 聚合酶、反轉錄酶和6 條特異性引物的作用進行目的核酸片段的大量擴增。 該方法的靈敏性比普通RT - PCR 高10 倍，與熒光RT-PCR 的靈敏度相當。 其特異性較高，只能特異性的檢測目的病毒，與其他同屬的病毒或類似病毒無交叉反應。 該方法的耗費低，不需要昂貴的儀器設備，反應迅速，其反應結果易于觀察，由于在檢測前加入熒光指示試劑，檢測結果可以直接用肉眼判斷。 可以滿足現場檢測的需求，具有較高的實際應用價值。 但其實驗設計復雜，讀取結果主觀性強。

3.4 納米金標記核酸探針 針對PPRV 的N 基因的高度保守區設計兩條特異寡核苷酸探針建立了納米金檢測方法[17]。 一條探針5′端修飾生物素，另一條探針3′端修飾巰基。 巰基化的探針通過Au-S鍵連接到納米金顆粒上。 靶核酸兩端分別與兩條探針結合，形成“生物素化探針-靶核酸-納米金探針”復合物，該復合物通過生物素-親和素系統，固定在固相載體上，最后銀染放大信號。 通過肉眼觀察法、光鏡觀察法、分光光度法分析銀染灰度，從而間接測定靶核酸的量。 初步檢測PPRV 核酸最低濃度達10 fmol/L，所需時間約為1.5 h。 該方法靈敏度高、操作簡單，可以為臨床檢測PPRV 核酸提供實驗數據和技術支持。

3.5 重組酶聚合酶擴增(RPA) 利用PPRV 的N基因建立了Real -time RT -RPA 和LFS RT -RPA檢測方法[18]。 Real -time RT -RPA 在40 ℃條件下，可檢出的最低濃度為100 拷貝，檢測時間不超過7 min；LFS RT -RPA 在39 ℃條件下25 min 內，可檢出的最低濃度為150 拷貝。 兩種方法的特異性較強，與羊痘、口蹄疫和羊口瘡病毒均無交叉反應，其靈敏性與RT-PCR 相當。 RPA 相對現有的檢測技術操作簡單、不易污染、便攜、快速、靈敏性和特異性強，有望應用于床旁和現場檢測。

表2 PPRV 核酸檢測方法

4 病毒抗體檢測

PPRV 的抗原和核酸檢測已經被廣泛應用于疫情檢測和日常監測。 但是，大多數的抗原和核酸檢測方法只能應用于疾病感染后4 ～17 d，而且還要小心運輸和保存抗原及核酸樣品。 與之相對比，抗體檢測(表1)可在易感動物感染PPRV 或接種疫苗產生抗體后的很長時間里持續的檢測(至少在接種后的3 年內)。 在病毒檢測中，病毒中和試驗(VNT)依舊是金標準，是國際貿易中指定的PPRV 檢測方法[19]。 VNT 靈敏度高、特異性強，但其耗費時間較長，一般需要10 ～12 d，最短也要7 d才能得到結果，勞動強度大，很難實現大規模樣品的檢測。

Saliki 等利用2 個抗H 基因的特異性單克隆抗體(MAb)建立了阻斷ELISA(b - ELISA)[20]。 b -ELISA 相對于VNT 的敏感性和特異性分別為90.4%和98.9%，兩種檢測方法的總體復合系數(n=253)為0.91。 b -ELISA 和終點滴定VNT 的相關系數較高(n =57)，兩種方法的相關性較高(R2≥0.98)。 b-ELISA 和VNT 的靈敏性和特異性接近但更簡便快捷，可以替代VNT 用于羊群免疫狀態的評估和流行病學檢測。 Libeau 等從大量培養的昆蟲細胞表達PPR N 蛋白的重組桿狀病毒中獲取了重組N 蛋白，建立了競爭ELISA(c -ELISA)[21]。c- ELISA 和VNT 的滴度表現出很好的相關性(R2≥0.94)。 與VNT 相比，c -ELISA 的敏感性和特異性分別為94.5%和99.4%。 該方法相對于傳統的VNT，更加的方便快捷，可以進行大批量檢測。被世界動物衛生組織(OIE)指定為PPR 標準檢測方法之一。 Ismail 等從大量培養的昆蟲細胞和幼蟲表達PPR N 蛋白的重組桿狀病毒中獲取了重組N 蛋白，建立了間接ELISA(i -ELISA)。 該方法相對于c - ELISA 的特異性和靈敏度分別為95. 09% 和90.81%，達到VNT 的100%和80%[22]。 在應用血清學方法進行流行病學調查時，i -ELISA 可以有效的替代c-ELISA。

5 小結

OIE 出版的《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中第2.7.10 章列出了當前可用于PPR 的診斷方法類型，并給出了每種方法的適用范圍。 根據檢測目的不同，給出了推薦方法、適用方法和可用方法。群體或個體無感染推薦使用病毒中和方法，競爭ELISA 也適用；臨床病例確診推薦使用普通RT -PCR、Real -time PCR 和免疫捕獲ELISA 3 種檢測方法，適用病毒分離，可用瓊脂凝膠免疫擴散和對流免疫電泳進行檢測；流行率的監測推薦使用競爭ELISA 和病毒中和進行檢測；個體或群體接種疫苗后的免疫狀況推薦使用競爭ELISA 和病毒中和檢測方法，可用瓊脂凝膠免疫擴散檢測。 并不是所有推薦方法和適用方法都經過了正式的標準化和驗證，它們日常的性質和已被廣泛使用而無可疑結果的事實，使得這些方法可被接受。 可用方法是指在某種情況下可以使用，但其成本、可靠性或其他因素限制其應用。

綜上所述，具有快速、特異、靈敏和高通量等特性的RT -PCR、熒光RT -PCR 以及多種ELISA 等檢測技術將成為PPR 的常用檢測方法。 另外，實驗操作相對簡單、耗時短、無需昂貴的儀器、可應用于野外和現場快速檢測的技術(如RPA)也將得到廣泛應用，這些技術將會為PPR 的監測和防控提供技術支持。