檢測用抗體標準樣品的研究現狀和展望

喬彩霞， 王 強， 劉艷華， 高志強， 周 建， 邊 勇， 劉 巍

(北京出入境檢驗檢疫局， 北京 朝陽 100026)

血清學檢測方法是利用抗原抗體在體外的免疫反應，實現疫病感染檢測和免疫效果評估，已在人類和動物疫病的監測和診斷中得到了普遍使用。常規的血清學方法主要包括有瓊脂免疫擴散試驗、血凝抑制試驗、補體結合試驗、病毒中和試驗和酶聯免疫吸附試驗等。 抗體標準樣品是用于血清學檢測方法質量控制和評價的重要材料，對于保證抗體檢測結果的準確性、一致性和可比性，實現檢測方法的標準化應用具有重要意義。 國內外已經研制了一些抗體標準樣品，為抗體檢測方法質量的提升提供了保障。 同時，世界衛生組織(WHO)和世界動物衛生組織(OIE)也均發布了生物類和抗體標準樣品的研制指南，用于指導檢測用抗體標準樣品的研制工作。 本文將介紹國內外抗體標準樣品研制規范和研究現狀，并分析其應用前景，以期為我國檢測用抗體標準樣品的制備和應用提供參考。

1 抗體標準樣品簡介

標準樣品，又稱標準物質(Reference material)是指具有一種或多種規定特性足夠均勻且穩定的材料，已被確定其符合測量過程的預期用途。 有證標準樣品(Certified reference material)是指經相關部門審批后，附有證書提供規定特性值及其不確定度的標準樣品。 其特性值可以是定量的或是定性的，包括物理、化學或生物特性量的值。 抗體標準樣品是生物類標準樣品的一種，用于血清學檢測方法和試劑的質量控制，多采用血清研制，也有部分采用單克隆抗體或脫脂牛奶等材料制備。 抗體標準樣品通常用血清學檢測反應來描述其特性值即抗體活性。

2 抗體標準樣品的研制

2.1 依據規范 世界衛生組織(WHO)早在1978年首次出版了制備和建立生物類標準樣品的指南，并在1986、1990、2004 年進行改版[1]，指南較為全面的規定了國際生物類標準樣品研制的技術要求，內容涉及樣品制備、效能檢驗和包裝分發、保存等環節，成為生物類標準樣品研制的重要參考。 世界動物衛生組織(OIE)專門發布了抗體標準樣品的研制指南[2]，內容包括候選血清樣品的來源、采集、檢測、保存等，其關鍵技術環節是抗體標準樣品的制備和特性檢測。 目前，我國尚缺乏針對抗體標準樣品的研制規范，研制多是借鑒國際組織的做法和經驗。

2.2 抗體標準樣品的候選材料 抗體標準樣品的候選材料應與被檢測樣品接近，并純凈、安全無污染。 因此，多數抗體標準樣品均由血清制備，要求候選血清無溶血和過量血脂，并經過2 種以上國際公認的方法檢驗確認，檢測特性包括特異性和抗體反應活性的測定，血清中不應含有與目標病原可能存在交叉反應的抗體。 條件容許的情況下，應選用無特定病原體或SPF 動物，通過實驗感染或疫苗免疫制備血清，血清樣品可以來自單個動物或來自許多動物的樣本的混合。 特殊情況下，當免疫或感染制備不可行時，血清也可采自自然感染動物。 血清采集后，還需消毒處理，并檢測證實無感染性病原存在。 牛血清應該來自無瘋牛病國家的動物。

2.3 抗體標準樣品的種類 血清學檢測技術可分為定性檢測和抗體滴度測定的定量檢測兩種類型，前者如免疫瓊脂擴散試驗、免疫熒光試驗等，檢測結果以陰、陽性體現。 后者如病毒中和試驗、血凝試驗，補體結合試驗，檢測結果以抗體滴度加以標識。 因此，對于大多數血清學方法常用的標準樣品包括強陽性、弱陽性和陰性樣品3 種，其中弱陽性樣品對于確定檢測方法的敏感性最為關鍵。 除此之外，抗體標準樣品還包括最低檢出量參考品、精密性參考品及定量標準品等，這些樣品是全面評價診斷試劑質量，控制檢測靈敏度、精密度及定量的重要參考[1-3]。

2.3.1 強陽性標準樣品 對于如補體結合、病毒中和或間接ELISA 等有著典型的S 型劑量-反應曲線檢測技術，強陽性標準樣品的反應活性檢測結果應處于曲線平臺期下的線性增長期；對于其他類型的檢測技術，其檢測結果應接近檢測范圍的上限，如免疫擴散試驗出現清晰沉淀線或競爭/阻斷ELISA 檢測為100%的阻斷率。

2.3.2 弱陽性標準樣品 對于有典型S 型劑量-反應曲線的檢測方法，弱陽性標準樣品的反應活性檢測結果應處于S 型曲線陰陽性臨界值稍上的線性增長期內，且結果明確不能存在爭議。 對于其他類型的檢測方法，弱陽性標準樣品的檢測結果應接近檢測范圍的下限，如在免疫擴散試驗中，弱陽性樣品的反應線應該淺而明確，在競爭/阻斷類檢測試驗中，陰陽性樣品結果的轉折較大，弱陽性標準樣品的制備難度較大，但與有典型S 型劑量-反應曲線的檢測技術的原則一樣，弱陽性樣品用標準程序檢測時結果應明確，且位于陽性/陰性臨界值之上較小的范圍內。

2.3.3 陰性標準樣品 陰性標準樣品用標準程序檢測時結果應始終低于陽性/陰性臨界值，且結果明確不存在爭議。

2.3.4 其他樣品 最低檢出量參考品、精密性標準品及定量標準品等，也是抗體標準樣品的重要組成。 最低檢出量標準樣品由系列稀釋陽性樣品組成，用來控制試劑的靈敏度，即試劑所能檢出的樣品中陽性物質的最低限度。 精密性標準品由一份經過確認的中等陽性樣品組成，用來控制試劑的精密度。 定量標準品應由一定數量經確證的陽性樣品組成，采用相應的國際定量標準品對樣品進行標化，設置量值及線性標準，用于控制定量試劑的準確性。

2.4 抗體標準樣品的制備、保存 陽性標準樣品應盡可能直接選擇含有相應抗體滴度的候選血清制備，但多數情況下，需要用陰性血清將陽性血清進行稀釋，從而獲得含有預期抗體滴度的陽性樣品，而弱陽性樣品也就可以通過稀釋同一批的強陽性樣品而制備。 所有樣品材料在制備期間應冷凍或冷藏保存，避免反復凍融。 為了保證穩定性，樣品在滅活病原后應凍干，同時配帶無菌稀釋液用于樣品的復溶。 長期儲存樣品時應盡可能選擇密封的玻璃安瓿瓶保存，這比帶橡膠帽的西林瓶有利于樣品的穩定。 即便常溫下短時間內樣品不會降解(如運輸期間)，凍干樣品仍應儲存在4 ℃。 一個批次的標準樣品，采集的候選材料應至少滿足5 年的使用，而凍干的標準樣品也應至少供應兩年的測試(500 次測試)，具體應根據預計使用的頻次和數量加以確定。 所制備的標準樣品或者凍干保存，或者儲存于-70 ℃條件，并保存有完整的每一批次的質量控制數據。 包裝一般為0.5 ～1 mL/瓶或者安瓿。

2.5 標準樣品的檢驗 制備好的標準樣品需進行物理性狀、無菌、抗體活性、均勻性和穩定性等一系列檢驗，以保證標準樣品的質量。 如標準樣品為凍干樣品，應疏松多孔、顏色均勻，表面無明顯的斷裂現象，加入稀釋液后能立即溶解。 冷凍干燥過程有時會影響抗體的反應活性，因此應采用國際公認的血清學方法，評價凍干前后活性的變化及樣品的均勻性和穩定性。 OIE 明確指定使用《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》國際貿易指定的檢測方法，測定抗體標準樣品的反應活性。 根據國際慣例，目前抗血清標準樣品不設“有效期”，由研制單位對樣品穩定性定期進行監測。

2.6 抗體標準樣品的定值 標準樣品在研制后，要求對樣品完成定值。 定值是對標準樣品特性量進行賦值的過程，是其作為一種實物標準能復現、保存和傳遞量值的保證。 標準樣品的定值方式有4種：用高準確度的絕對或權威測量方法定值；用兩種以上不同原理的已知準確度的方法定值；多個實驗室協作定值；以及與已有的標準樣品比對定值。由于生物類標準樣品不能應用物理和/或化學的方法進行準確量值描述，抗體標準樣品的特性值被賦值為抗體強陽性、弱陽性或陰性，而其具體的量值顯示往往和具體使用的檢測方法密切相關。 對于不能精確定量的標準樣品，通常要求聯合6 ～8 家以上權威實驗室采用國際公認的方法協作定值，對結果統計分析確定陰、陽性，并在所附的數據清單中說明其抗體反應活性。 國際抗體標準樣品賦值的典型例子如WHO 提供的布魯菌抗體血清(凍干)樣品其量值表示為1 000 IU 凝集活性和補體活性/安瓿，國際單位(IU)定義為在每0.09552 mg 國際標準樣品含有的抗體活性。

2.7 標簽和資料清單 標準樣品需加貼標簽，標簽應至少包含以下信息：名稱、陰陽性、制備實驗室、重溶條件、儲存條件等，空間不足可使用縮寫，部分信息也可在資料清單內體現。 資料清單是標準樣品使用的重要說明材料，內容應包括：樣品供體動物、抗體來源(感染或免疫)和病原的詳細信息；感染或免疫的程序；篩選方法、反應活性、異源抗體、安全性等檢測結果；滅菌方法；批號、生產日期、處理和儲存條件等常規信息；制備實驗室的完整聯系地址、傳真、電子郵件等。

3 研究現狀

3.1 國際研究現狀 目前，國際醫用/獸用生物標準樣品主要由WHO、OIE 和聯合國糧農組織(FAO)3 大國際組織進行規范和推廣應用。 WHO 目前批準的生物類標準樣品有300 余種，其中用于動物疫病診斷的抗體標準樣品僅有10 種[4]，主要由倫敦的國家生物標準樣品與檢定所(NIBSC)和英國國家獸醫實驗室(VLA)提供，所提供的抗體標準樣品均為凍干樣品，并附有國際單位(詳細見表1)。FAO 則主要通過技術援助系統幫助成員國建立和實施生物制品的質量控制系統，也承擔一些對外發放標準樣品的職能，自身并不承擔驗證和提供標準樣品的職責。 OIE 是審核和發放獸用標準樣品的重要組織，截至目前，共批準了23 種國際標準血清[5]，針對了19 種動物疫病，涉及13 種類別的檢測方法(詳細見表2)。 這些抗體標準樣品均為國際一級標準樣品，通常用于國際、國家和其他實驗室檢測技術的校準，國際貿易中檢測結果的互認，并作為二級標準樣品生產的依據，從表1 和表2 可以看出，美國、英國和法國等發達國家都參與了抗體國際標準樣品的研制工作，而我國明顯滯后。

3.2 國內研究現狀 在我國，有證國家標準樣品由全國標準樣品技術委員會實施、監督和管理，經過國家標準化管理委員會評審、審批和發布，主要是為了配合國際和國內文字標準的使用，實現檢測方法的質量控制和標準化應用。 我國生物類標準樣品的起步較晚，開展了一些抗體標準樣品的研究工作，但獲得的有證標準物質相對較少。 目前，醫用/獸用生物標準樣品主要由中國藥品生物制品檢定所和中國獸醫藥品監察所保管和分發，現可提供乙型肝炎，艾滋病等16 種人類傳染病抗體血清標準樣品(詳見國家標準樣品資源共享平臺(http：/ /www. ncrm. org. cn)，均可溯源到國際一級標準樣品。 動物疫病檢測領域，可提供布魯菌病、豬瘟等24 種動物傳染病抗體血清標準樣品(見表3，來源于國家獸藥基礎信息查詢系統標準樣品數據庫http：/ /sysjk. ivdc. org. cn：8081/cx/)。 但現有抗體血清標準樣品的研制不夠規范，未能達到國際和國家標準樣品的技術要求[5-6]。

4 抗體標準樣品研制中存在的主要問題

經過幾十年的發展，國內外抗體標準樣品的研制、認可和發布已得到了一定的發展，但在種類和賦值方面，抗體標準樣品尚存在諸多問題，亟待解決[7-9]。

4.1 樣品數量少，不能滿足疫病檢測的需要 目前動物疫病抗體國際標準樣品主要由OIE 提供，覆蓋的病種僅有19 種動物疫病[5]，目前針對禽流感、非洲豬瘟等嚴重危害養殖業和公共衛生的動物疫病，尚沒有相應的抗體標準樣品提供。 在我國，雖然標準樣品針對的動物疫病種類達到了23 種，但研制與OIE 指南不太相符，未能同時研制一種疫病的強陽性、弱陽性和陰性樣品，不足以用于檢測技術的標準化；其次，標準樣品信息不夠完整，缺乏研制單位、樣品狀態、適用范圍等關鍵信息不足以滿足檢測技術的標準化。 隨著經濟全球化進程加快，實現動物疫病檢測技術的標準化和國際互認已經成為影響動物及其產品貿易的重要因素，目前進出境動物檢疫中涉及的疫病已多達200 種，因此，針對重要的動物疫病研制抗體標準樣品急需豐富完善。

表1 WHO(NIBSC)提供的動物疫病抗體血清標準樣品

表2 OIE 批準的動物疫病抗體國際標準血清樣品

表3 我國現有動物疫病抗體標準樣品

4.2 量值標定難，制約檢測結果可比性 作為標準樣品，要有明確的量值，生物類標準樣品的定值和不確定度分析，是目前研究的熱點和難點。 目前僅有有限的幾種動物疫病，國際上有公認的抗體反應活性單位，大多數動物疫病目前尚缺乏用于確定其反應活性單位的體系。 WHO 依據抗體標準樣品生物學活性或者免疫反應活性作為其衡量單位，即國際單位(international units， IUs)。 國際單位的使用，便于檢測技術的國際化，提供了衡量免疫或感染狀態的國際認可的重要基礎。 目前，我國僅有布魯菌、雞毒支原體和雞白痢、雞傷寒標記了國際單位。 WHO 和OIE 在標準樣品的定值中均尚未引入不確定度，ISO 標準樣品工作導則中明確定性標準樣品的不確定度可用概率表示[10，11]，抗體樣品的特性值如何表示還有待結合實際檢測工作進行研究和探討。

4.3 樣品種類單一，阻礙檢測方法和試劑的全面評價 陽性、陰性抗體標準品是傳染病體外檢測試劑最為常用的兩種樣品，這也是我國和國際上目前主要研制的抗體標準樣品。 但要實現傳染病體外檢測試劑的精確定量檢測，全面評價診斷試劑的質量，還需要研制精密性標準品、最低檢出量參考品及定量標準樣品，從而更為準確的評價檢測技術的特異性、靈敏度、精密度等。

5 應用前景展望和結語

2013 年，我國國務院印發了《計量發展規劃(2013 -2020 年)》，其中提出加強標準樣品研究和研制的工作任務，包括開展基礎前沿標準樣品研究，擴大國家標準樣品覆蓋面，填補國家標準樣品體系的缺項和不足，滿足食品安全、生物、環保等領域和新興產業檢測技術配套和支撐需求。 2017 年，我國發布《全國動植物保護能力提升工程建設規劃》(2017 -2025 年)，明確要提高我國獸用標準物質的研制質量，促進獸醫生物制品、診斷試劑和化學藥品質量提升。

動物疫病標準樣品是動物疫病診斷和防控的必要基礎，抗體標準樣品可用于血清學檢測方法的建立、驗證和評價檢測試劑的質量、實驗室能力驗證和人員素質的考核，也是與國外實驗室開展技術交流的重要媒介。 完善和規范抗體標準樣品的研制、認可和公布，不僅可提高抗體標準樣品研制的技術水平，也有助于檢測結果的準確可靠和國際互認。