新疆尼勒克縣牛布魯菌病及新孢子蟲病流行病學調查

段永只， 張 楊， 吾力江， 杜蘭蘭， 李才善， 巴音查汗

(新疆農業大學動物醫學院， 新疆 烏魯木齊 830052)

布魯菌病是由布魯菌侵入機體引起的變態反應性人獸共患傳染病，可引發流產、不孕和各種組織的局部病灶，簡稱布病。 該病廣泛分布于世界各國，不僅嚴重危害畜牧業的發展，而且對人類的健康帶來巨大威脅。 布魯菌病的傳染源主要為患病動物，病畜可長期或終生攜帶布魯菌，對其他動物和人類具有一定程度的威脅。 病原菌在水和土壤中存活72 ～112 d，在乳內存活3 ～15 d，在冷暗胎兒中存活6 個月，故該病可隨患畜的流產物、乳汁、尿液排出體外，通過被污染的草場、圈舍、飼料等引起動物感染。 感染途徑以消化道、呼吸道、生殖道為主，也可通過眼結膜、生殖道和損傷皮膚感染。

新孢子蟲病是由寄生于多種動物有核細胞內的犬新孢子蟲(Neospora caninum)引起的繁殖障礙性的原蟲病。 該病即可垂直傳播也可水平傳播，懷孕母畜感染出現流產、弱產、產死胎等；新生兒則多表現為四肢運動障礙和神經系統疾病等。 新孢子蟲可以感染多種的哺乳動物，該病呈全球性分布，給養殖業帶來了巨大的經濟損失[1-3]。

近年來，畜牧業在我國得到迅速發展，牲畜的流動和交易日益頻繁，該病制約了畜牧業發展及造成重大經濟損失和嚴重公共衛生問題。 本次試驗選擇新疆尼勒克縣作為調查點，于2016 年2 月至2017 年5 月在尼勒克縣范圍5 個區域進行了牛布病及新孢子蟲病的流行病學抽樣調查，為逐步防控布魯病和新孢子蟲病提供相關流行病學數據。

1 樣品來源

2016 年2 月至2017 年5 月對尼勒克縣范圍5個區域采集不同性別牛血樣1 966 份，分離血清，同時記錄牛只的編號、年齡。 -20 ℃冷凍保存，待檢。

2 試劑與器材

布魯菌病虎紅平板凝集試驗：抗原、標準陽性血清、標準陰性血清(哈藥集團生物疫苗有限公司生產，生產批號：201703，規格：5 mL/瓶)；羊抗牛血清玻璃板；A4 紙其上劃分成4 cm2的方格；吸管或移液器；牙簽。

新孢子蟲病rELISA 試驗：兔抗馬IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；羊抗牛血清(BETHYL公司)；兔抗羊血清、NcSRS2 重組抗原、TgSAG2 抗原(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；標準陽性、臨床陰性血清(美國IDEXX 生物科技有限公司)。

3 試驗方法及判定標準

3.1 虎紅平板凝集試驗 將血清和抗原在室溫放置30 ～60 min；將玻璃板上各格標記被檢血清號，然后加相應被檢血清0.03 mL；在被檢血清旁滴加虎紅平板凝集抗原0.03 mL；用牙簽類小棒攪動血清和抗原，使之充分混合，在白熾燈下5 分鐘內觀察結果；每次試驗應設陰性血清、陽性血清對照。

判定結果：受檢血清在4 min 內出現肉眼可見凝集現象者判為陽性( +)，無凝集現象，呈均勻粉紅色者判為陰性( -)。

3.2 新孢子蟲病的rELISA 檢測方法 嚴格參照文獻[4]建立的rELISA 方法進行檢測。

新孢子蟲地方蟲株NcSRS2 重組抗原，按7 μg/mL劑量加到包被液中(50 mmol/lcarbonate bicarbonate buffer，pH 值9.6)，混勻后加到96 孔平底微量板(Nunc，Denmark)的孔里，每孔100 μL，并且在4 ℃條件下培養過夜。 用含有0.05% Tween20 的PBS沖洗3 次后，殘留粘附物的部位用含0.5%脫脂乳的封阻液進行封阻，每孔200 μL，并在37 ℃條件下培養1 h。 微量板用沖洗液沖洗3 次，在封阻液中按1∶100 的滴度稀釋被檢血清后，每個樣品平行加到微量板的2 個孔中，每孔100 μL，并在37 ℃條件下培養1 h。 用沖洗液沖洗3 次后，在封阻液中按1∶4 000的滴度稀釋用辣根過氧化物酶結合了的羊抗牛的IgG 抗體，稀釋后每孔加50 μL，并在37 ℃條件下培養1 h。 用沖洗液沖洗6 次后，每孔加100 μL 底物-四甲基聯苯胺(TMB)室溫孵育25 min 后終止反應，在620 nm 波長下讀板并記錄OD 值。

判定標準：參照試劑盒的標準，陰、陽性臨界值定義為陰性血清平均OD 值ˉX + 3SD。 即當OD450/OD630值≥+ 4SD 時判為陽性；當OD450/OD630值＜ˉX+2SD 時判為陰性；當ˉX +2SD≤OD450/OD630值＜ˉX+4SD 時判為可疑陽性，重新做檢測，若檢測結果仍為疑似陽性的則判定為陽性。

4 試驗結果

對1 966 份牛血樣全部進行了檢測。 其中布病檢測結果顯示，陽性血樣51 份，陽性率為2.59%。其中新孢子蟲病檢測結果顯示，陽性血樣26 份，陽性率為1.32%。 經調查，檢測樣品中，有97 頭牛有過流產現象，其中，51 頭感染布病，26 頭感染新孢子蟲病，無交叉感染。 見表1、表2 及表3。

表1 布病虎紅平板凝集檢測試驗

表2 新孢子蟲rELISA 檢測

表3 流產牛中感染兩種疾病的感染率調查結果

5 討論

牛布魯菌病和新孢子蟲病是導致牛流產的主要原因。 近年來，該地區流產牛的病例逐年上升，嚴重影響畜牧業發展及畜產品生產。 新疆尼勒克縣位于中國新疆西北部，隸屬于伊犁哈薩克自治州，屬于以牧為主，農牧結合的偏遠山區縣，據統計，該縣2015 年牛存欄量為22 萬頭，當地牛只飼養方式主要為草場散養及圈養，且每年有外來引進牛只。 為調查該地區牛布病及新孢子蟲病的感染情況，以尼勒克縣5 個地區采取血樣1 966 份，經檢測，布魯菌病感染率為2.59%；新孢子蟲病感染率為1.32%。 經調查，檢測樣品中，有97 頭牛有過流產現象，其中，51 頭感染布病，26 頭感染新孢子蟲病，無交叉感染；這兩種疾病的發生正是導致流產的主要原因。

導致該病的主要原因：(1)畜主缺乏對布病及新孢子蟲病的認識及防護意識薄弱；(2)飼養量不斷增多，免疫(未做到一針一畜)、病畜及流產物處理等易感染發病；(3)冬、夏季草場跨區域較多、牲畜頻繁轉場及調運；(4)工作經費及人員等相關問題，檢測篩查并不完全，對檢出陽性布病牛只需撲殺牲畜也沒有做到完全凈化；(5)異地引畜逐年增加，對引進牛只的檢查不完善，通過牛只自然交配，加快了布魯菌病及新孢子蟲病的傳播速度。

布病及新孢子蟲病的防治以免疫和檢疫為主，應采取“檢、隔、免、殺、消”等相結合的綜合防控措施[4]。 豬二號菌苗對于牛的布魯菌病用法為飲服、喂服和注射，對牛的免疫期為1 年；而對于牛新孢子蟲病的感染特效藥、疫苗仍在研究階段。 對此兩種病的預防應做到以下幾點：(1) 通過網格化逐步篩查對檢測為陽性牛進行淘汰或隔離飼養，政府可通過病牛換健康牛鼓勵畜主參與，對自愿淘汰或在規定低屠宰的政府給予相應的補償，降低畜主經濟損失[5]；(2) 對受污染的場地、草灘、用具、飼草等徹底消毒，防治疫病蔓延；(3)布魯菌病陽性牛只屠宰淘汰。 肉品及其他附屬產品徹底煮熟后再進行焚燒、深埋等無害化處理，受污染的環境及用具徹底消毒，工作人員在處理時要做好防護措施；(4)對無法撲殺的病畜，落實病畜隔離，應固定場地、用具，指定專人喂養，加強飼養管理，進行藥物治療，促進其康復自愈；連續兩次檢疫轉陰后可以解除隔離。 另外，可督促畜主及時上報空胎、流產、產死胎、弱胎的牲畜，以防發生新病源在畜群間蔓延。也可利用電視、廣播、宣傳冊等手段宣傳布病及新孢子蟲病防控知識，提高廣大養殖農戶對該病的防范意識和自我保護意識。 同時，相關工作單位應加強對養殖戶及技術人員的技術培訓，以達到提高防控疾病的能力和業務水平。