組織工程技術再生卵巢的初步研究*

楊如鏡 潘婷 林麗娜 黃曉帆 吳淑卿 王興玲

由卵巢腫瘤、性腺發育不全等導致的卵巢功能衰竭成為輔助生殖技術最大難題。2004年，Johnson等首次提出卵巢中存在生殖干細胞[1]，隨后證實了出生后的小鼠卵巢中存在卵母細胞和卵泡的更新[2]。其他研究者也分別分離、培養了新生及成年小鼠，以及人的卵巢干細胞（Germline stem cells）[3-5]。這些發現為卵巢衰竭患者帶來了新的希望。組織工程技術再生卵巢是利用卵巢來源的細胞、生物材料及組織工程技術構建人工卵巢，移植入體內，達到提高這些患者生活質量如內分泌激素分泌或最終生殖能力的改善等目的[6-7]。用于再生醫學的生物材料有多種，筆者使用明膠海綿作為支架，種植標記來源于小鼠卵巢的細胞，初步探討卵巢細胞移植后存活情況，觀察明膠海綿體內降解情況，以期為今后構建人工卵巢提供參考，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 使用8～12周SPF級KM雌鼠，購于汕頭醫學院實驗動物中心，飼養在溫度22～25 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗的環境中。

1.1.2 生物材料支架 可吸收Ⅰ型膠原海綿（typeⅠ absorbable collagen sponge，Integra Lifesciences，美國）。

1.1.3 熒光標記物 CellTrackerTMCM-DiI（Invitrogen，美國），儲存液配制：用二甲基亞砜（DMSO）配制為2 mg/mL，分裝后保存于-20 ℃，避免反復凍融。工作液配制：使用前用PBS配制，濃度為1 μM。

1.1.4 消化酶 用不含血清的DMEM/F12配制終濃度為 3 mg/mLⅠ型膠原酶（typeⅠ collagenase，sigma，美國）及 4 mg/mL 中性蛋白酶（dispase，sigma，美國），分裝后-20 ℃備用，避免反復凍融。

1.2 方法

1.2.1 卵巢細胞分離 取6只雌鼠，脫頸椎處死，75%酒精消毒腹部皮膚后剪開皮膚及腹腔，找到輸卵管及卵巢，在體視顯微鏡下分離出卵巢，盡量去除卵巢周圍的脂肪及結蹄組織，換干凈培養皿，用無菌眼科剪碎后加消化酶。37 ℃孵育30 min后，過70 μm細胞濾網（BD，美國），離心，洗滌。

1.2.2 細胞培養及熒光標記 分離的細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12（Gibco 低糖，美國）24孔板中，放入6%CO2培養箱。24 h細胞貼壁后換液，繼續培養至3 d準備熒光標記。熒光標記物采用 CellTrackerTMCM-DiI（invitrogen，美國）。貼壁細胞用 PBS洗滌后，加入 0.5 mL CM-DiI工作液，37 ℃孵育5 min，然后放入碎冰上繼續孵育15～20 min。去除染色液，用 PBS洗滌 2次后，加入新鮮培養液放入培養箱培養。不同時間熒光顯微鏡觀察、計數標記細胞比例。培養的標記細胞計數方法：選擇培養孔中不同區域熒光顯微鏡計數標記細胞，然后去除培養液，PBS洗滌2次后加入 1 μg/mL DAPI（Sigma，美國）染色 5～10 min，熒光顯微鏡計數同樣區域的細胞核。每個時間點最少計數3孔、5個區域細胞，計算平均值。新鮮分離懸浮細胞熒光標記：取12只雌鼠，分離卵巢組織，剪碎的組織酶消化、離心、PBS洗滌后，加入CM-DiI工作液0.5～1.0 mL至每個離心管中，37 ℃水浴孵育5 min，然后離心管放入碎冰中繼續孵育15～20 min，離心去除染色液，PBS洗滌2次后，懸浮于少量培養液（細胞終濃度為5×106/mL）中待用。

1.2.3 構建移植體及小鼠皮下移植 膠原海綿支架用手術刀切成3×6 mm，放置入干燥的6孔板，200～300 μL熒光標記的卵巢細胞種植于明膠海綿支架中。將種植細胞的支架放入培養箱2～3 h，等待細胞黏附于海綿支架。6只8～12周小鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.1 mL，麻醉后腹臥于手術臺上，常規消毒背部皮膚，用手術剪沿背部正中矢狀線剪開皮膚約1 cm，用組織鉗分離皮下組織，取出種植細胞的移植體，仔細放入小鼠背部皮下，縫合切口。小鼠放回后觀察復蘇后活動情況。3只小鼠移植后7 d脫頸椎處死，取出移植體，快速冰凍切片、DAPI染液封片，熒光顯微鏡下觀察。3只小鼠移植后3周脫頸椎處死，取出移植體，10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色后顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 卵巢分離細胞的培養 卵巢分離的細胞有多種類型，如成纖維細胞、顆粒細胞、內皮細胞以及來源于卵巢皮質的生殖干細胞等。24 h換液后，只有貼壁細胞如成纖維細胞、顆粒細胞等可以繼續生長，用于觀察細胞示蹤劑CM-DiI對卵巢細胞的標記以及熒光信號的動態變化。

2.2 培養細胞的熒光標記及動態觀察 CellTrackerTMCM-DiI為DiI衍生物，低細胞毒性，含有能與硫醇反應的氯甲基基團，使染料可以共價結合到細胞硫醇上。這樣，與其他膜染料不同，細胞在分裂時熒光染料可以進入子細胞，保持熒光強度達數個細胞分裂周期，并可在細胞固定和滲透步驟中保持穩定的標記。本實驗在標記后24 h觀察，98.3%的細胞被標記。培養3 d時可觀察到個別細胞從貼壁變為懸浮，以后逐漸增加，懸浮的細胞熒光信號逐漸減弱。1周后，熒光標記細胞比例為66.4%，大部分懸浮細胞熒光信號消失；培養至2周，幾乎所有細胞失去熒光信號。提示用于移植細胞體內示蹤，在短期體內實驗（1周內）是一種方便使用、熒光信號較強及可靠的示蹤劑。體外培養細胞CM-DiI熒光標記，見圖1。熒光信號動態變化，見表1。

圖1 體外培養的卵巢細胞示蹤劑染色（×20）

表1 CM-DiI標記卵巢細胞熒光信號的動態變化

2.3 移植體在小鼠體內的存活 構建的卵巢細胞-生物支架移植體在植入動物體內1周后，冰凍切片熒光顯微鏡觀察可見到大量的移植卵巢細胞，說明膠原海綿支持卵巢細胞在體內的生長。移植3周后，石蠟包埋切片HE染色，可見到膠原海綿支架仍未被降解，細胞在支架空隙中大量生長，并有類似于血管的結構生成，見圖2。但未發現典型的卵泡樣結構，可能與筆者分離細胞時過細胞濾網，原始或竇前卵泡被濾除有關。

圖2 卵巢細胞-生物支架動物移植3周后移植體內細胞及支架的變化（HE染色，×100）

3 討論

組織工程技術是近年新興的一門學科，是利用生物學、材料科學及工程學原理研發生物組織器官替代品，達到恢復或改善疾病或創傷組織器官的功能及形態的目的[6-7]。構建三維人工卵巢替代卵巢組織冷凍移植，成為恢復女性內分泌及生殖功能的又一選擇[8-9]。筆者用可降解的Ⅰ型膠原海綿作為生物支架，與血纖維蛋白（fibrin）、基質膠（matrigel）及水凝膠（hydrogel）相比[10-12]，海綿材料有孔隙，除了可以為卵巢細胞提供附著支架外，支架中的孔隙還可以為卵巢細胞的生長、遷移提供空間，有利于營養物質、生長因子及內分泌因子的運輸以及血管的生成[13-16]。卵巢細胞用CM-DiI標記，體外實驗顯示，細胞1周后仍有66.4%的細胞標記，是一種理想的短期體內實驗細胞示蹤劑。體外培養還觀察到，培養1周后發生部分細胞脫壁，懸浮在培養液中，可能使細胞發生凋亡，這些細胞熒光信號也逐漸淬滅，提示對活細胞示蹤的影響較小。

體內移植組織切片顯示膠原蛋白海綿支持卵巢細胞生長，在海綿的孔隙中細胞生長旺盛，并發現類似血管樣結構，說明所用生物支架具有良好的組織相容性，支持卵巢細胞的體內生長，可作為今后構建人工卵巢的生物材料。

構建人工卵巢的巨大挑戰是分離有生殖功能的細胞，如原始卵泡或卵巢生殖干細胞。分離原始卵泡構建人工卵巢已有多個研究，與冷凍卵巢組織移植相比，對卵巢腫瘤患者可降低腫瘤再發風險[10]。卵巢干細胞的優勢是可以體外增殖，有望成為恢復或重建卵巢生殖功能的一個新的生殖細胞來源。本研究也為今后利用組織工程技術構建人工卵巢，治療卵巢早衰提供了一個新途徑。

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