酸奶生產中噬菌體污染的判斷及防治

李海濤，王慕華，趙玉明，杜盈，張國柱，宮俊峰

(1.山西維爾生物乳制品有限公司，太原030006；2.山西省生物研究所，太原030006)

0 引言

在酸奶生產過程中，噬菌體污染常有出現[1-2]。噬菌體污染發生后，輕則發酵菌種生長受阻，產酸、產粘能力下降，酸奶不凝固，酸奶的風味、營養下降；重則使酸奶發酵無法繼續進行，生產被迫停止，給乳制品行業帶來巨大危害[3-4]。常見的噬菌體防治方法有環境凈化、更換生產菌株、抗噬菌體菌株選育等[5-6]。本文從生產實際出發研究了酸奶異常發酵時噬菌體污染的初步判斷及不同防治措施的效果，為今后酸奶生產中噬菌體污染的預防與應對提供合理的解決方法。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

酸奶生產菌株：嗜熱鏈球菌（Streptococcus therm ophilus，S.t.），保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbu lgaricus，L.b）由本公司保藏。

嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株與保加利亞乳桿菌融合子由山西省生物研究所選育、保藏[2,7-8]。

噬菌體：從多次酸奶異常發酵液中分離獲得。

1.1.2 培養基

M RS培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，M g-SO4·7H2O 0.58 g，M nSO4·4H2O 0.25 g，吐溫80 lm L，蒸餾水1 000 m L，pH值6.2-6.4，固體培養基添加1.5%的瓊脂。用于保加利亞乳桿菌的培養[9]。

M 17培養基：植質蛋白胨5.0 g，聚蛋白胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉浸膏2.5 g，抗壞血酸0.5 g，β-甘油磷酸二鈉19 g，1.0 m ol/L M gSO4·7H2O 1.0 m L,蒸餾水1000 m L，pH值7.1，固體培養基添加1.5%的瓊脂。用于嗜熱鏈球菌的培養[9]。

雙層瓊脂培養基：M 17培養基，下層加1.5%瓊脂，上層加0.8%瓊脂。

脫脂乳培養基：牛乳脫脂后115℃滅菌15 m in，冷卻后置于冰箱冷藏備用。

1.2 測定方法

活菌數計算采用發酵液適度稀釋涂平板計數；酸奶滴定酸度測定法按GB5409-85測定；黏度測定采用NDJ-1型旋轉黏度計，取牛乳發酵后冷藏過夜的樣品進行測定。

1.3 方法

1.3.1 噬菌體污染的初步判斷

對發酵異常的酸奶產品進行乳清分離，將分離后的乳清分為2份，并將其中1份經95℃/15 m in殺菌并冷卻至45℃以下備用。按配方要求配制適量牛奶并定容至配料總量的80%～90%，經95℃/5 m in殺菌并冷卻至41～43℃后分成2份備用。分別用2份乳清將2份牛奶定容至100%，接入乳酸菌種（經過證實為未污染的與發酵異常酸奶所用的同型號菌種），進行42℃保溫發酵培養。對2份產品的發酵過程進行跟蹤比較，初步判定是否為噬菌體感染。

1.3.2 噬菌體污染的確定

噬菌體污染的確定采用雙層平板法，將8 m L左右的1.5%瓊脂含量的M 17培養基倒入無菌培養皿中，靜置待凝固后備用。將異常發酵液10倍梯度稀釋到合適梯度，吸取0.1m L敏感菌液和0.1m L的異常發酵液加入到5 m L滅菌試管中，加入熔化并冷卻至45～50℃的0.8%瓊脂含量M 17培養基4 m L，混合均勻，小心倒入準備好的下層平板上，注意不要弄出氣泡，待上層凝固后，正置放入42℃培養箱中培養48 h，取出觀察有無噬菌斑。

1.3.3 更換生產菌株及使用抗噬菌體菌株

噬菌體污染發生后，在酸奶生產車間使用20 L中試生產線，更換酸奶發酵菌種或使用抗噬菌體菌株，觀察、跟蹤酸奶的發酵情況。

1.3.4 環境凈化

噬菌體污染發生后，徹底對發酵車間進行清洗和消毒，對管件連接處進行檢查，防止出現清洗死角，完善和加強清洗消毒程序，確保地面上沒有牛奶或乳清殘留，在處理發酵產品和菌種時必須清洗和消毒雙手及設備，嚴格執行作業區域管理，禁止無關人員進入發酵區域。

2 結果與討論

2.1 噬菌體污染的初步判斷

酸奶的異常發酵包括酸奶凝固時間延長，酸度、粘度下降，風味異常等，出現這種情況時就應及時進行是否為噬菌體污染的判斷。排除抗生素，消毒劑和清洗劑殘留，強氧化劑等影響，對比異常發酵液乳清對凝乳的影響，結果如圖1和表1所示。

圖1 添加異常乳清時活菌數

表1 異常發酵液對酸奶發酵的影響

由圖1及表1可知，添加未滅菌的酸奶異常發酵液乳清，酸奶發酵時發酵菌株生長受阻，發酵酸奶不凝固，產酸、產黏能力大幅下降，由此可以初步判斷酸奶發酵受到噬菌體污染。

2.2 噬菌體污染的確定

初步判斷酸奶發酵受到噬菌體污染后，可進一步采用雙層平板法進行確認，雙層平板培養48 h后，如平板上出現噬菌斑，即可確定酸奶生產出現噬菌體污染。

2.3 更換生產菌株對防治噬菌體的影響

噬菌體污染發生后，更換生產菌株，生產3批次，每次發酵的活菌數及發酵結果如圖2和表2所示。

圖2 更換生產菌株后不同批次活菌數

表2 更換生產菌株不同生產批次酸奶發酵結果

由圖2及表2可知，更換生產菌株后，短期內可以控制噬菌體的污染，這是因為噬菌體感染敏感菌株具有很強的專一性，更換菌株與敏感菌株在表面結構等方面存在差異，噬菌體污染暫時得到控制。但噬菌體結構簡單，極易發生突變，生產幾個周期后，噬菌體有可能變異，更換的菌株變為敏感菌株，污染再次發生。

2.4 使用抗噬菌體菌株對防治噬菌體的影響

目前公司保存的抗噬菌體菌株有兩種，一種為針對近期噬菌體污染從敏感菌株嗜熱鏈球菌中選育到的抗近期各種噬菌體的嗜熱鏈球菌抗性菌株；一種為通過細胞融合技術，選育到的由嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株與生產用保加利亞乳桿菌融合產生的生產性狀優良的具有抗噬菌體能力的融合子。在噬菌體污染發生后，采用抗噬菌體菌株進行酸奶發酵3批次，發酵結果如圖3、圖4及表3所示。

由圖3、圖4及表3可知，單純的嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株短期內對噬菌體防治有一定的效果，隨著生產的連續進行，有可能抗性菌株發生回復突變，也有可能噬菌體變異，污染又會出現，且使用單一抗性菌株，酸奶性狀不好[10]。使用抗多種噬菌體的融合子，3批次發酵未見污染且酸奶性狀較好，這是因為融合子融合了雙親的特性且表面結構發生變化，在對抗噬菌體變異方面效果較好。

2.5 環境凈化對防治噬菌體的影響

噬菌體污染后，對生產環境進行徹底整治，環境消毒每天進行，管道設備日日清洗、消毒，每天凈化后進行發酵生產，3批次生產結果如圖5和表4所示。

圖3 單-抗噬菌體菌株不同批次活菌數

圖4 融合子不同批次活菌數

表3 不同抗噬菌體菌株不同生產批次酸奶發酵結果

Rh：嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株與保加利亞乳桿菌融合子

圖5 環境凈化后不同批次活菌數

表4 環境凈化后不同生產批次酸奶發酵結果

由圖5和表4可以看出，環境凈化雖不能立竿見影消除污染，但還是有一定效果的。

2.6 環境凈化結合更換生產菌株對防治噬菌體的影響

環境徹底凈化后，更換生產菌株，生產3批次，結果如圖6和表5所示。

圖6 環境凈化后更換菌株不同批次活菌數

表5 環境凈化結合更換生產菌株不同生產批次酸奶發酵結果

由圖6和表5可以看出，環境凈化結合更換生產菌株可以很好地預防噬菌體污染且不影響酸奶品質。

3 結論

（1）噬菌體污染在酸奶生產中時有發生，污染發生后可通過異常發酵液在5 h左右快速初步判斷是否為噬菌體污染，使企業能夠及時做出反應，防止污染的進一步擴大，減少損失。

（2）污染發生后，防治噬菌體的有效途徑有兩條，一是環境凈化結合更換生產菌株；二是篩選具有抗噬菌體能力且生產性狀優良的融合子。這兩種途徑不僅可以有效的預防噬菌體污染，又不影響酸奶的品質。

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