HPLC-ELSD測定嬰幼兒配方乳粉中低聚果糖總量

張書芬，畢曉麗，應璐，周子焱，邢家溧，滿正印，沈堅

（寧波市食品檢驗檢測研究院，浙江寧波 315040）

0 引言

低聚果糖是一種天然活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進鈣吸收，調(diào)節(jié)免疫，抗齲齒等功能[1]。同時，GB 14880-2012[2]中也明確規(guī)定了其在嬰幼兒配方食品中使用的最大限量不超過64.5 g/kg。

目前，低聚果糖檢測方法的研究主要集中在液相色譜和離子色譜上[3-14]。其大多以蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖為目標物，外標法進行定量。這種方法僅適用于檢測產(chǎn)品中添加了以蔗糖為原料，利用果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用轉(zhuǎn)化而成的低聚果糖的檢測。而不適用于以菊苣或菊芋為原料，經(jīng)酶解或酸解而生成的聚合度為2～9的低聚果糖的檢測[15]。2017年新實施的國標GB 5009.255-2016[5]的檢測方法雖然能檢測低聚果糖的總量，但該方法需要配有三元及以上梯度泵,脈沖安培檢測器的離子色譜儀，設備價格昂貴，且專用性強，所以不適于推廣。本文在參考AOAC 997.08[16]及國標中酶解法原理的基礎上，建立了一種對嬰幼兒配方乳粉中低聚果糖總量進行檢測的實用方法。

1 實 驗

1.1 主要儀器

安捷倫1260液相色譜儀（具有蒸發(fā)光散射檢測器）；艾卡渦旋振蕩器；德國優(yōu)萊博恒溫水浴搖床；Therm o離心機。

1.2 材料

1.2.1 試劑

果糖標準物質(zhì)（純度≥99.0%），果聚糖酶（外切酶活力20 000 U）；蔗糖酶（酶活力300 U），乙腈為色譜純，實驗室用水為超純水；氫氧化鈉、馬來酸鈉、乙酸、硼氫化鈉等其他試劑均為分析純。

1.2.2 試劑的配制

(1)硼氫化鈉溶液(質(zhì)量濃度10m g/m L):準確稱取適量硼氫化鈉(精確至0.001 g)于聚丙烯離心管中,用濃度為50mm ol/L氫氧化鈉溶液溶解,用時現(xiàn)配。

(2)蔗糖酶溶液(5.0 U/m L)∶將蔗糖酶(活力為300 U)溶解于60m L馬來酸鈉緩沖溶液(濃度100mm ol/L,pH=6.5)中,分裝到2m L的離心管中,-20℃保存,可放置6個月。

（3）乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.5)∶吸取14 m L乙酸溶液(濃度為200 mm o l/L)和11 m L乙酸鈉溶液(200 mm ol/L)混合,并用水稀釋至50m L,用時現(xiàn)配。

（4）果聚糖酶溶液(500 U/m L)∶將果聚糖酶(活力為20 000 U)溶解于40 m L乙酸鈉緩沖溶液,分裝到2 m L的離心管中,-20℃保存,可放置6個月。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱（250 mm×4.6 mm,5μm），流動相（乙腈∶水=85∶15），流速為1.0 m L/m in， 進樣體積為20μL，柱溫為40℃。

檢測器條件:霧化溫度為85℃，霧化器流量為1.6 m L/m in，增益為8.0。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5 g左右試樣于錐形瓶中,加入80℃熱水約30m L,置于80℃±1℃恒溫水浴搖床中,150 r/m in振搖15 m in后,冷至室溫轉(zhuǎn)移定容至50 m L容量瓶中，過濾或離心備用。根據(jù)樣品中低聚果糖的具體含量和標準曲線的線性范圍確定稀釋倍數(shù)。

若樣品中含有蔗糖，取上述樣液300μL于10m L具塞玻璃試管中,按每毫克蔗糖加入125μL蔗糖酶溶液(5.0 U/m L)加入蔗糖酶溶液,旋渦振蕩混勻,置于40℃±1℃恒溫水浴搖中,150 r/m in振搖60 m in后,加入300μL硼氫化鈉溶液,繼續(xù)振搖30 m in后,取出,冷卻至室溫后加入750μL乙酸溶液,靜置10m in。按每毫克低聚果糖加入250μL果聚糖酶溶液(500 U/m L)加入果聚糖酶溶液,旋渦振蕩混勻,于上述同樣條件下振搖30 m in冷卻至室溫后定容至2.5 m L，過0.22μm水相濾膜上機待測。若樣品中不含蔗糖，取上述樣液300μL于10m L具塞玻璃試管中，直接加入果聚糖酶進行實驗。

2 結果與討論

2.1 酶解條件的優(yōu)化

前處理過程蔗糖酶用來酶解樣品中蔗糖使其水解成果糖和葡萄糖，生成的葡萄糖和果糖經(jīng)硼氫化鈉還原成相應的糖醇，而樣品中的低聚果糖不受酶解和還原影響，樣品中的低聚果糖經(jīng)過果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖,經(jīng)HPLC-ELSD測定果糖含量,通過折算得到果聚糖的含量。由于果聚糖酶也能夠一定程度上水解蔗糖，所以如果蔗糖水解不完全，將會影響檢測結果，使檢測數(shù)據(jù)偏高。果聚糖酶如果添加不夠，水解不完全，將使低聚果糖不能完全被檢測到，從而使檢測結果偏低，所以酶解條件的優(yōu)化十分重要。

在300μL樣品稀釋液中添加1 m g蔗糖，加入不同量的蔗糖酶進行酶解，通過測定生成的果糖含量的變化來確定每毫克蔗糖需要的蔗糖酶的量。同理，對每毫克低聚果糖需要的果聚糖酶量進行考察。實驗結果如圖1所示。從圖中可以看出，每毫克蔗糖中加入125μL蔗糖酶，每毫克低聚果糖中加入250μL果聚糖酶可以達到完全酶解的效果。

趙丹霞[17]等人的研究表明，嬰兒奶粉一般不添加蔗糖，較大嬰幼兒奶粉中一般不超過10 g/100 g。低聚果糖添加量一般為1～3 g/100 g之間，GB14880-2012規(guī)定低聚果糖與低聚半乳糖等添加總量不超過6.45 g/100 g。按照實驗考察出的酶的酶解能力計算，在嬰幼兒配方乳粉中蔗糖酶的添加量一般不超過375μL，果聚糖酶的添加量一般不超過500μL。

圖1 蔗糖酶和低聚果糖酶加入量對果糖檢測結果的影響

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱及的流動相比例的優(yōu)化

果糖、葡萄糖等糖類一般選用氨基柱進行檢測。本文分別采用氨基柱和ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱進行了比較。實驗表明，兩根色譜柱都能對果糖、與葡萄糖和糖醇進行分離，但都不能將葡萄糖和糖醇分離，由于實驗中是通過測定果糖含量后，通過折算來測定低聚果糖總量，所以從分離角度，兩根色譜柱都能滿足分離要求。但相同測定條件下，氨基柱基線噪音明顯高于糖分析專用柱，這可能是由于糖分析專用柱是在氨基柱的基礎上添加了乙?；?，使柱流失減小的緣故，故本文選用ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱作為測試柱。

蒸發(fā)光檢測器的檢測原理決定其需使用易揮發(fā)的流動相，一般不添加無機鹽。本文選用水和乙腈作為流動相。在本文色譜條件下，通過考察各組分的分離程度、果糖的峰形、基線噪音三方面來優(yōu)化流動相比例。試驗考察了四組乙腈與水不同比例的情況，具體效果如圖2所示。

圖2 不同流動相比例的色譜

由圖2可以看出，隨著流動相中水相比例降低，儀器的基線噪音越低，并且果糖與葡萄糖和糖醇的分離度更好，但同時色譜峰延展變寬，且隨著水相的比例增加響應值變低。為了保證良好的分離度、峰形和較低的基線噪音，本研究選擇乙睛∶水為85∶15的流動相比例。

2.2.1 蒸發(fā)光檢測器霧化氣流量的選擇

作為通用型檢測器，蒸發(fā)光檢測器其響應不依賴于樣品的光學特性，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品經(jīng)霧化蒸發(fā)后得到的顆粒散射光后均能被檢測。霧化氣流小，可以形成較大的霧滴，有利于散射光的增強，目標物響應增強。但霧化氣流過小會使流動相揮發(fā)不完全，背景、基線增高，污染檢測器。所以試驗中分別選取1.4,1.6，1.8，2.0 m L/m in霧化氣流量進行了優(yōu)化。實驗結果表明當霧化氣流量為1.6 m L/m in時，在背景干擾、基線噪音和響應之間達到了一個比較好的平衡。

2.3 檢測結果的折算

試驗中直接測定結果為果糖含量，折算成低聚果糖采用GB5009.255-2016中的計算公式，低聚果糖聚合度以4計。

2.4 標準曲線、檢出限和定量限

用純水配制20，50，80，100，1500，300 m g/L質(zhì)量濃度的果糖標準系列溶液，在選定的色譜條件下上機，獲得冪函數(shù)方程為y=35.46120x1.08788（其中y為峰面積，x為果糖質(zhì)量濃度），相關系數(shù)r=0.99957。

另外，還考察了方法的檢出限和定量限，當信噪比（S/N）為3時，果糖的上機檢出限為10 m g/L，折算成低聚果糖的檢出限為1.0 g/kg，低聚果糖的定量限為3.0 g/kg。

2.5 精密度和回收率

在未添加低聚果糖的嬰幼兒配方乳粉樣品中添加定量限、5倍定量限和國標限量水平質(zhì)量分數(shù)的標樣，按選定試驗方法進行加標回收實驗，每個加標樣品平行測定6次，結果如表1所示。

2.6 樣品分析與國標對比

對標簽中明示添加了低聚果糖的5批嬰幼兒配方乳粉進行測試，并外送樣品按照GB5009.255-2016標準進行檢測，本方法與國標方法比較結果如表2所示。

表1 低聚果糖在嬰幼兒配方乳粉中的回收率和精密度

表2 本文方法和國標方法測定結果比較

3 結 論

通過酶加入量、色譜柱、流動相比例、霧化氣流量等條件的優(yōu)化，首次建立了一種高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器測定嬰幼兒配方乳粉中低聚果糖總量的方法。該法準確可靠，三水平加標回收率均在86.7%～105.1%之間。檢測結果與國標法具有一致性，5批次實際樣品檢測結果和國標方法對比，絕對偏差均小于8%。由于該法使用儀器設備價格低，實驗室基本配備，比國標方法更具有實際應用和推廣價值。為低聚果糖的檢測及推廣應用提供一定的參考，為營養(yǎng)標簽的規(guī)范標識提供技術支持。

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