同位素特異肽段在乳清蛋白定量分析中的應用

王震,姚美伊，凌云，李曉娟，李奇峰，陳達

（1.天津大學精密儀器與光電子工程學院，天津 300071；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

0 引言

乳清蛋白的兩種主要成分是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，對嬰幼兒的睡眠及神經發育具有重要作用。傳統的檢測方法有毛細管電泳法[1]、十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳法[2]、高效液相色譜法[3]、反相高效液相色譜法[4]、液相色譜-質譜聯用法[5]等，但因乳清蛋白在嬰幼兒配方奶粉中存在變性的狀態，傳統方法無法測定總蛋白含量[6]。

Zhang等[7]研究表明α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特異肽段不受蛋白質變性狀態的影響，可用于兩種蛋白質的準確定量，α-乳白蛋白的特異肽段序列為VG INYW LAHK內標物序列為VGI*NYWL*AHK，β-乳球蛋白的特異肽段序列為IDALNENK及內標物為I*DAL*NENK。

因此本研究以兩種蛋白的同位素特異肽作為內標，采用液相色譜—質譜聯用法對兩種蛋白進行了定量，并驗證了方法的穩定性。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈（色譜純），實驗用水為M illi-Q超純水；標準品采用牛功能蛋白檢測試劑盒包括α-乳白蛋白特異肽（2.0μm o l/L，分子量 1199.7 u）、β-乳球蛋白特異肽（4.0μm ol/L，分子量915.5 u）、α-乳白蛋白同位素特異肽（2.0μm ol/L，分子量 1214.4 u）、β-乳球蛋白同位素特異肽（4.0μm o l/L，分子量929.5 u）、α-乳白蛋白同位素標記內標（2.0μm o l/L，分子量2784.39 u）、β-乳球蛋白同位素內標（4.0μm o l/L，分子量3346.93 u）、牛胰蛋白酶溶液（500μg/m L）、碳酸氫銨（NH4HCO3）溶液（500 mm ol/L）、碘代乙酰胺（IAA）溶液（500 mm o l/L）、二硫蘇糖醇（DTT）溶液（500 mm ol/L）、氯化鈣（CaC l2）溶液（100 mm o l/L）。奶粉樣品共13個（包括嬰幼兒配方奶粉樣品8個，用于配制嬰幼兒配方奶粉的乳清蛋白原料3個，脫脂奶粉原料2個）。

1.2 儀器與設備

WA TERSACQU ITYTM超高效液相色譜儀，質譜儀QTRAP 5500，TRIPLE QUAD 4500，QTRAP4000，XE VOTM TQ，M S 6490；天平（PL203，感量0.01 g）；超聲振蕩器（KQ-500型）；渦旋混合器（VORTEX-QILINBEIER-5）；恒溫水浴鍋（B-491）,超純水儀（Milli-Q公司）；容量瓶（100 m L，10 m L）；離心管（2 m L）；聚丙烯樣品瓶（2009 p-1232-100，2 m L）；移液槍頭（10，200，1 000μL）；移液管（10 m L）。

1.3方法

1.3.1 樣品前處理

參照牛功能蛋白檢測試劑盒（Realgoal HA15004）[6]。稱取固體樣品2 g(精確至0.01 g)于100 m L容量瓶中，用90 m L水將樣品充分溶解，置于渦旋混合器或超聲波震蕩器中短時溶解，并用水定容至刻度。混勻后移取1.0 m L上述樣品并用水定容至10 m L，再次混勻后準確移取200μL試樣于2 m L離心管中，加入50 m L同位素內標中間混合液，150μL碳酸氫銨溶液、10μL DTT溶液，混勻后置于75℃恒溫水浴30m in；冷卻至室溫，加入30μL的IAA溶液，暗處靜置30m in；再加入10μL的CaC l2溶液、50μL牛胰蛋白酶溶液、充分混勻后置于37℃恒溫水浴鍋中酶解5 h，用10μL甲酸混勻，室溫下靜置15 m in，加入490μL水，渦旋混勻。供液相色譜串聯質譜儀檢測。

1.3.2 儀器工作條件

色譜條件：色譜柱 ACQU ILTY UPLC Peptide BEH C 18，1.7μm，2.1 mm×100 mm，流動相A為0.1%甲酸-水，B為0.1%甲酸-乙腈；柱溫40℃；進樣量5.0μL；梯度洗脫：0～0.8m in,5%B,0.8～1.2m in,5%～10%B,1.2～2.5 m in,10%～17%B,2.5～2.6 m in,17%～23%B,2.6～3.8m in,23%B,3.8～4.0 m in,23%～100%B,4.0～4.8 m in,100%B,4.8～5.0m in,100%～5%B,5.0～5.7m in 5%B。

質譜條件(AB5500)：電噴霧電離源,正離子模式,多反應監測，氣簾氣:40霧化氣:40,輔助氣:50,電噴霧電壓:5500,去溶劑溫度:450。

1.3.3 標準曲線的繪制

配置α-乳白蛋白特異肽段濃度為：5，25，75，150，300，500 nm ol/L；內標法添加α-乳白蛋白同位素特異肽段濃度為100 nm o l/L。配置β-乳球蛋白特異肽段濃度為：10，50，150，300，600，1 000 nm o l/L；內標法添加β-乳球蛋白同位素特異肽段的濃度為200 nm ol/L。

1.3.4 方法的實驗室內重復性

分別在5個實驗室采用5種不同的液相色譜串聯質譜儀開展實驗室內的日內及日間重復性試驗，對同一種奶粉進行每天六次平行測定實驗，連續測定3 d，并按照公式（1）計算α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的質量濃度：

式中：X：為試樣中牛α-乳白蛋白，或β-乳球蛋白的質量分數；ρ為根據標準曲線計算得到的試樣酶解液中牛α-乳白蛋白，或β-乳球蛋白的質量濃度；V為試樣的定容體積；m為試樣質量；f1為待測試樣溶液的稀釋倍數；10-4為將質量濃度單位μg/m L換算為m g/m L的換算系數。

1.3.5 方法的實驗室間再現性

按照前處理方法，分別在5個實驗室分別測試13種奶粉樣品，每個樣品平行測定兩次，根據公式（1）計算α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的質量濃度，然后計算每個樣品測試結果計算相對標準偏差（RSD）和再現性限（R），考察方法針對不同樣品的實驗室間再現性。

2 結果與討論

2.1 同位素特異肽在5種不同質譜儀上的質荷比優化結果

α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的特異肽段及同位素特異肽段的質譜信息如表1～表5所示。在5種不同質譜儀器上蛋白質的質荷比的差異小于0.2,但離子信號強度有所差異，如質譜儀QTRAP 5500產生的子離子355.3的信號強度要高于子離子284.3的強度，而在其他幾臺質譜儀器上子離子284.3的信號強度更高，可根據不同儀器選取定量離子對。

表1 質譜儀型號為QTRAP 5500，AB SCIEX的MRM質譜參數

表2 質譜儀型號為TR IPLEQUAD4500,ABSCIEX的MRM質譜參數

2.2 離子流圖

在QTRAP5500 AB儀器上，利用ESI+模式對α-乳白蛋白特異肽、β-乳球蛋白特異肽及兩種同位素內標的離子流圖進行了監測，結果如圖1所示。因α-乳白蛋白特異肽、β-乳球蛋白特異肽及其內標因具有相同的分子結構，因此在色譜保留時間上具有一致性，兩組蛋白的保留時間分別是4.02 m in和2.76 m in。但可通過內標物與特異肽的質量數對兩者進行區分。

表3 質譜儀型號為QTRAP4000,AB SCIEX的MRM質譜參數

表4 質譜儀型號為XEVOTM TQ,WATERS的MRM質譜參數

表5 質譜儀型號為MS6490,Agilent的MRM質譜參數

圖1 多級監測離子流

2.3 線性關系

內標法采用特異肽的面積與同位素特異肽峰面積比值作為縱坐標，以濃度為橫坐標進行線性回歸，得到α-乳白蛋白特異肽的回歸方程y=0.00768x-0.0297,R2=0.9954.得到β-乳球蛋白特異肽段的回歸方程y=0.00578x-0.0202,R2=0.9974.表明兩種蛋白質均具有良好的線性關系，可用于定量分析。

2.4 方法的實驗室內重復性

表6列出了5個不同實驗室開展實驗室內的實驗室內日內及日間重復性考察結果，α-乳白蛋白的日內RSD在1.23%～10.1%之間，日間RSD在4.13%～12.2%之間；β-乳球蛋白日內RSD在1.06%～10.3%之間，日間RSD在1.52%～12.0%之間。

2.5 方法的實驗室間再現性

表7和表8為所有樣品（共13個，包括嬰幼兒配方奶粉樣品8個，用于配制嬰幼兒配方奶粉的乳清蛋白原料3個，脫脂奶粉原料2個）在5種儀器上的測定結果。表7和表8中，每個樣品測試結果計算再現性限（R），考察方法針對不同樣品的實驗室間再現性，結果表明，對于α-乳白蛋白，RSD在10.4%～18.4%之間。平均測定值小于1.0%的5個樣品，再現性限（R）在0.19～0.44之間，平均測定值在1.0%～2.0%的6個樣品，再現性限（R）在0.49～0.77之間，對于α-乳白蛋白含量較高的2個樣品，平均測定值分別為9.71%和30.2%，再現性限（R）分別為3.58和16.7。對于β-乳球蛋白，RSD在10.7%～23.6%之間。其中1個含量較低的樣品，平均測定值為1.34%時，再現性限（R）為0.71，平均值在2.85%～3.89%的8個樣品，再現性限（R）在1.03～2.36之間，對于質量分數較高的3個樣品，平均測定值分別為6.38%，15.9%，34.1%；再現性限（R）分別為3.50，9.51，20.5。

3 結 論

本研究建立了一種測定嬰幼兒奶粉中變性及非變性的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白總量的高效液相色譜-串聯質譜法，此方法采用同位素特異肽作為內標物，利用C 18色譜柱對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特異肽進行了分離，兩種蛋白的線性關系良好可以進行定量測定，實驗室內重復性標準偏差在1.06%～12.2%，實驗室間再現性標準偏差為10.4%～23.6%。傳統方法只能測定非變性的乳清蛋白成分，本研究彌補了這一不足之處，提供了一種準確測定總乳清蛋白成分的方法，并在不同液相質譜儀器上進行了應用，為嬰幼兒奶粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的檢測提供方法參考。

表6 方法的重復性考察%

表7 α-乳白蛋白測定的實驗室間再現性考察結果 %

表8 β-乳球蛋白測定的實驗室間再現性考察結果 %

參考文獻:

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