山羊乳餅中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良乳酸菌的初步篩選

馬青雯，王馨聆，王昱敬，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201）

0 引言

乳酸菌廣泛存在于自然界中，是國(guó)際公認(rèn)的食品安全級(jí)微生物（GRAS）[1]。乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮良好的作用與乳酸菌自身的性能有關(guān)，除了在腸道內(nèi)達(dá)到一定數(shù)量之外，對(duì)腸胃環(huán)境中高酸度、膽鹽、膽汁、胰酶等具有一定的耐受性才能順利達(dá)到腸胃內(nèi)部實(shí)現(xiàn)定殖[2]。

乳餅是是云南三大傳統(tǒng)乳制品之一，至今已有600多年歷史[3]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然馴化，乳餅及乳清中富含的乳酸菌及其生物學(xué)特性得到了很好的保存。楊希良，王昱敬[4]，楊玉森[5]等對(duì)乳餅中的乳酸菌進(jìn)行了研究，但至今關(guān)于乳餅中優(yōu)良乳酸菌的篩選鮮有報(bào)道。本研究旨在對(duì)云南大理地區(qū)傳統(tǒng)乳餅中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，并篩選特性優(yōu)良的乳酸菌，為云南地區(qū)益生特性優(yōu)良乳酸菌的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

（1）菌種和細(xì)胞：鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus，LGG）為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)中心保藏；人腸上皮細(xì)胞HT-29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。

（2）試劑：MRS培養(yǎng)基，M 17培養(yǎng)基，RPM I-1640培養(yǎng)基，PBS緩沖液，改良型RPM I-1640培養(yǎng)基，胰酶，0.1%的T riton-X 100，0.4%臺(tái)盼藍(lán)，胎牛血清（Fetalbovine serum,FBS-Standard）。

（3）儀器：倒置顯微鏡（AE200），澳柯瑪超低溫冰箱（DW-86L390），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（A360），二氧化碳培養(yǎng)箱（1PH-460），尼康光學(xué)顯微鏡（E200），生物安全柜（HF-safe-1200LC）。

2 方法

2.1 樣品的采集

6份山羊乳餅樣品采集自云南省大理市白族地區(qū)，采樣地點(diǎn)如表1所示。嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行樣品的采集。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后放入4℃冰箱中保藏[7]。

表1 山羊乳餅采樣地點(diǎn)

2.2 乳酸菌的分離鑒定

2.2.1 乳酸菌的分離、純化與初步鑒定

將樣品進(jìn)行研磨后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水中進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)捎脙A注法培養(yǎng)微生物[8]。根據(jù)菌落形態(tài)特征，劃線分離純化3次后挑取單菌落于M RS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)及培養(yǎng)液pH值測(cè)定，確定純種，革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株置于-80℃的超低溫冰箱中保藏。

2.2.2 乳酸菌16S rRNA序列鑒定

將分離純化后的乳酸菌用16S rRNA基因序列分析法進(jìn)行鑒定，其中DNA的提取使用DNA提取試劑盒，PCR方法參照文獻(xiàn)[6]。PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行的雙向測(cè)序，得到序列后利用SeqM an軟件進(jìn)行序列拼接，獲得約1 500 bp的有效序列[9-10]，登陸 NCBI（www.ncbi.n lm.gov/blast/）網(wǎng)站，進(jìn)行同源性分析和序列比對(duì)。

2.3 益生菌株的篩選

2.3.1 耐酸性實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11]配制人工胃液。將分離鑒定得到的乳酸菌進(jìn)行活化，取傳至第3代菌株按體積分?jǐn)?shù)5%,分別接種于pH值為6.2，3.5，3，2.5的模擬胃液中,以pH值為6.2的模擬胃液為對(duì)照組，于37℃下恒溫培養(yǎng)。在培養(yǎng)0和2 h[12]后稀釋涂板，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，根據(jù)活菌數(shù)判定乳酸菌的耐酸情況。

存活率計(jì)算公式：存活率=（處理組活菌數(shù)/對(duì)照組活菌數(shù)）×100%。

2.3.2 小腸液耐受性實(shí)驗(yàn)

模擬小腸液的配制參照文獻(xiàn)[13]中方法。取傳至第3代菌株按體積分?jǐn)?shù)5%分別接種于小腸液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.30%，0.50%的MRS液體培養(yǎng)基中；于37℃下恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h和6 h后稀釋涂板，利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株活菌數(shù)。

2.3.3 黏附實(shí)驗(yàn)

HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[14]；活菌數(shù)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]。

黏附實(shí)驗(yàn)：參考K im[16]的實(shí)驗(yàn)方法稍加改變。采用PBS緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x擇適宜的3個(gè)梯度涂板，每個(gè)處理作3個(gè)平行，38℃培養(yǎng)48 h后計(jì)算平均每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)，并與參考菌株鼠李糖桿菌（LGG）比較。

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌的分離鑒定

3.1.1 分離菌株的理化特性

6份樣品中分離的46株乳酸菌的理化特性如表2所示。

由表2可以看出：在6份樣品中分離出46株菌，46株菌革蘭氏染色均呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)46株菌均呈陰性。46株菌的培養(yǎng)液pH值最低為4.17，pH值最高為4.68。由菌株形態(tài)學(xué)特征和理化特性可鑒定出46株疑似乳酸菌。奎夢(mèng)漪[17]從20份成熟酸菜樣品中分離出12株乳酸菌，王昱敬[18]從9份傳統(tǒng)乳扇樣品中分離出32株乳酸菌，張振宇[19]從3份傳統(tǒng)傣家酸魚(yú)中分離到10株菌，本研究結(jié)果與以上報(bào)道相似。

3.1.2 乳酸菌16S rRNA序列鑒定結(jié)果

46株疑似乳酸菌的16S rRNA序列鑒定結(jié)果如表3所示。

6份大理羊乳餅樣品中分離出的46株乳酸菌，通過(guò)16S r RNA基因序列對(duì)比，有3個(gè)屬：腸球菌（Enterococcus）、片球菌（Pediococcus）、鏈球菌（Streptococcus），6個(gè)種：馬腸鏈球菌（Streptococcusequi）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、解沒(méi)食子酸鏈球菌（Streptococcusgallolyticus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。其中菌株DLR 4-5-4與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcus faecium同源性為99%故被鑒定為屎腸球菌，其他45株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性為100%。此外乳球菌的分離率遠(yuǎn)高于乳桿菌，乳球菌分離率為97.83%，其中腸球菌占71.74%，屎腸球菌占46.67%，馬腸鏈球菌占19.56%。這可能是因?yàn)槭耗c球菌是兼性厭氧的乳酸菌，和大多數(shù)乳酸菌一樣，其耐酸耐高溫等抗逆性能力差，但是對(duì)于嚴(yán)格厭氧、培養(yǎng)和保存條件苛刻的乳酸菌而言屎腸球菌更易于生長(zhǎng)，同時(shí)大理地區(qū)氣候溫和，氣候類(lèi)型為低緯度高原季風(fēng)氣候，四季溫差小[20-21]為屎腸球菌的生長(zhǎng)提供了基礎(chǔ)。

3.2 益生菌株的篩選結(jié)果

3.2.1 耐酸性能

用分離鑒定得到的46株菌在模擬胃液中進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

乳酸菌具有良好的耐酸性是保障其順利進(jìn)入胃腸道的先決條件。人體的胃部是一個(gè)高酸度的環(huán)境，pH值在1.5到4.0之間，成年人pH值約為2.0，在空腹條件下為1.5[7]，進(jìn)食后胃液pH值被稀釋?zhuān)琾H值上升至3.5左右[22]。食物通過(guò)胃的時(shí)間較短，一般為1～2 h，故選擇在2 h后進(jìn)行活菌數(shù)的測(cè)定[7]。由表4可知，46株分離純化菌株在4個(gè)pH值下培養(yǎng)2 h后顯示出不同的活菌數(shù)。46株菌在pH值為6.2的條件下活菌數(shù)均在105～106m L-1之間，說(shuō)明菌株活力較好，適合進(jìn)行耐酸實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)酸處理菌株DLR 1-1-4，DLR 2-1-2，DLR 3-2-4，DLR 3-3-3，DLR 4-7-4，DLR 6-12-2在pH值為3.5的條件下活菌數(shù)≥107m L-1；其中菌株 DLR 1-1-4，DLR 2-1-2，DLR 3-3-3，DLR 4-7-4在pH值為3.5和3的條件下活菌數(shù)≥107m L-1，這表明此4株菌具有更優(yōu)的耐酸性，能在高濃度的胃液中存活并進(jìn)入小腸。

表2 分離菌株的理化特性

表3 從乳餅樣品中分離鑒定的乳酸菌

3.2.2 小腸耐受性

選取pH值在2.5～3.5條件下活菌數(shù)在105～106m L-1之間的12株菌模擬小腸液進(jìn)行小腸耐受實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

人體小腸中膽汁鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%之間波動(dòng)[23]，乳酸菌在小腸液中活菌數(shù)高則表明乳酸菌對(duì)小腸液有良好的耐受能力。常人進(jìn)食后食物在小腸內(nèi)停留的時(shí)間大致為6～8 h[24-25]，故選擇在6 h后測(cè)定活菌數(shù)。由表5可知，0 h時(shí)12株菌的活菌數(shù)均≥105m L-1。6 h后在濃度為0.10%與0.15%的模擬小腸液中菌株DLR 3-2-4及DLR 6-12-2活菌數(shù)均≥107m L-1，此外在0.10%，0.1.5%，0.30%的小腸濃度中，菌株DLR 1-1-4，DLR 3-2-4，DLR 3-3-3，DLR 3-5-3，DLR 4-7-4，DLR 6-12-2活力較好，活菌數(shù)均在105m L-1以上，這表明6株菌對(duì)模擬小腸液有良好的耐受性能在小腸內(nèi)存活。

表4 乳酸菌對(duì)酸的耐受性

表5 乳酸菌對(duì)小腸耐受性

3.2.3 黏附性

選取模擬小腸液3個(gè)濃度下活菌數(shù)≥105m L-1的6株菌進(jìn)行體外黏附實(shí)驗(yàn)。由于鼠李糖乳桿菌（LGG）黏附能力較強(qiáng)[26-27]，故用LGG作為對(duì)比，結(jié)果如表6所示。

表6 乳酸菌黏附細(xì)胞數(shù) m L-1

乳酸菌能通過(guò)胃腸嚴(yán)苛的環(huán)境并能在小腸壁上黏附是乳酸菌定植和大量繁殖的前提,故乳酸菌在宿主細(xì)胞上黏附能力的強(qiáng)弱是衡量乳酸菌益身功能的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。由表6可知，2 h后菌株DLR 6-12-2和LGG與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)與0 h時(shí)比無(wú)顯著差異，2 h后其他乳酸菌與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量與0 h時(shí)比差異顯著。2 h后菌株DLR 6-12-2與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量與對(duì)比菌株LGG無(wú)顯著差異；其他菌株與對(duì)比菌株LGG相比差異顯著，其中菌株DLR 1-1-4和DLR 4-7-4與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量比LGG低，其他菌株與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量比LGG高。此外6株菌對(duì)人腸上皮細(xì)胞HT-29均表現(xiàn)出不同程度的黏附，DLR 1-1-4黏附率為 2.69%，低于其他菌株；菌株DLR 3-2-4，、DLR 4-7-4,DLR 6-12-2的黏附率較高，黏附率分別達(dá)到16.33%，15.72%,18.16%均高于LGG黏附率，這表明菌株DLR 3-2-4，，DLR 4-7-4,DLR 6-12-2能在胃腸道內(nèi)定殖。

4 結(jié)論

6份大理羊乳餅樣品中分離出的46株乳酸菌，通過(guò)16S r RNA基因序列對(duì)比，有3個(gè)屬，6個(gè)種，其中屎腸球菌為優(yōu)勢(shì)菌。通過(guò)耐酸及耐小腸液實(shí)驗(yàn)從46株乳酸菌中篩選出6株對(duì)強(qiáng)酸及膽汁都具有良好的耐受性的乳酸菌，活菌數(shù)較高，能保證一定數(shù)量的菌體通過(guò)環(huán)境嚴(yán)苛的胃腸道；通過(guò)黏附性實(shí)驗(yàn)得到菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DLR 4-7-4黏附性優(yōu)于參考菌株LGG。耐受性實(shí)驗(yàn)及黏附性實(shí)驗(yàn)表明菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DR 4-7-4不僅能通過(guò)胃腸道并能在胃腸道內(nèi)定殖；因而菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DLR 4-7-4優(yōu)良乳酸菌。

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