牦牛乳RNA的完整性及其硬脂酰去飽和酶（SCD1）基因表達分析

張嘉齊，羅毅皓，孫萬成

（青海大學農牧學院動物科學系，西寧810016）

0 引言

RNA通常是從組織、全血和培養的細胞中提取獲得[1]。高質量且完整的總RNA是進行后續分子生物學研究的關鍵步驟[2-4]。但RNA的單鏈結構使其極易發生降解[5-7]。RNA的濃度、純度、完整性是評價RNA質量的主要標準[8]。RNA的純度是通過測定RNA在260 nm及280 nm下的吸光值來確定[9-10]，RNA的完整性可利用瓊脂糖凝膠電泳[11-12]、實時定量PCR[13-15]和RNA完整數值（RNA Integrity N umber，R IN）進行評價。牦牛乳中豐富的蛋白質和脂肪[16-18]，會給總RNA的分離純化及后續分子試驗帶來較大困難，但Izum i等[19]通過定量PCR檢測到m RNA以一個相對高水平存在于牛乳中，并且還可抵抗工業加工，在嬰兒配方乳粉中少量存在。。因此本試驗以牦牛乳為試驗原料，研究不同的處理及加工對牦牛乳中RNA純度及完整性的影響，為在從分子水平上對牦牛乳及牦牛乳制品進行研究提供基礎數據。

1 實驗

1.1 材料與試劑

2016年4～9月和2017年4月，從牧民家中采集牦牛乳，早晨手動收集牦牛牛乳為研究樣本，牦牛乳的樣本采集量約為300m L。采集結束之后，將收集的牦牛乳分裝在50 m L Rnase-Free離心管中，用冰袋包裹后及時送到實驗室存放在-20℃的冰箱中。

RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒，熒光定量染料（SYBR G reen II），DL1000 DNA Marker，瓊脂糖，RN ase Free dH2O，核酸染料（4s R ed Plus Nucleic Acid Stain），2×Taq Master Mix（Dye Plus），牦牛硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD 1）引物由大連寶生物工程有限公司合成。如表1所示。

表1 牦牛SCD 1基因cDNA克隆引物

1.2 儀器與設備

冷凍離心機（2－16KL），PCR儀（PCR System 9700），電泳儀（JY 600），凝膠成像系統（Gel Doc XR＋），熒光定量儀（CFX 96）。

1.3 牦牛乳的不同處理

（1）對新鮮牦牛乳進行不同溫度的加熱處理，即40，50，60，70，80，90℃加熱30 m in，提取牦牛乳總RNA，檢測純度及完整性。

（2）將2016年4月、5月、6月、7月、8月、9月采集的新鮮牦牛乳置于-20℃冰箱中冷凍至2017年4月，將牦牛乳解凍后提取總RNA，檢測純度及完整性。

（3）對牦牛乳進行不同形式的加工，將新鮮牦牛乳預凍[20]30 m in后置于真空冷凍干燥機中，溫度為-60℃，100 kPa冷凍干燥12 h后提取牦牛乳凍干粉總RNA檢測純度及完整性，將牦牛乳凍干粉保存于-20℃；將新鮮牦牛乳加工成乳酪后，提取牦牛乳酪總RNA檢測純度及完整性，將牦牛乳酪保存于-80℃。

1.4 總RNA的提取

對于-20℃凍存的牦牛乳，取出后應立即放于37℃的水浴鍋中加熱至完全溶解后取500μL進行總RNA的提取；真空冷凍干燥的牦牛乳凍干粉，取30 m g進行總RNA的提取；牦牛乳酪應取300m g進行總RNA的提取。

向離心管中加入350μL Bu ffer R L，震蕩后室溫靜置2 m in；將裂解液轉移到gDNA Eraser Spin Colum n中，14 800 r/m in離心2 m in；取濾液加入等體積的體積分數為70%乙醇，混勻后立即將混合液全部轉入到 RNA Spin Co lum n中，12 000 r/m in離心1 m in，棄濾液；加入500μL Buffer RWA ，12 000 rpm離心30 s，棄濾液；加入600μL Buffer RWB，12 000 rpm離心30 s，棄濾液；加入50μL DN ase I，室溫靜置15 m in；加入600μL Buffer RWB ，12 000 rpm離心30 s，棄濾液；將RNA Spin Co lum n重新安置于2 m L Co llection Tube上，12 000 rpm離心2m in，棄濾液；在RNA Spin Colum n膜中央加入20μL RN ase Free dH2O，室溫靜置5 m in，12 000 r/m in離心2 m in洗脫RNA。

提取出的RNA可立即使用或將其貯存于-80℃的冰箱中備用。

1.5 RNA質量濃度和純度的測定

取1μL提取的總RNA，用超微量分光光度計測其濃度及OD 260/OD 280的值。純度較高的RNA的OD 260/OD 280值應該介于1.8～2.0之間[21]。

1.6 RNA完整性的分析

取10μL提取到的牦牛乳總RNA與2μL 6×Loading Bu ffer混合，點樣于1%的瓊脂糖凝膠于150 V電泳20 m in，凝膠成像系統觀察其完整性。

1.7 RT-PCR分析

RT-PCR對cDNA的純度和質量都有較高的要求，為了驗證提取牦牛乳RNA的效果，進行RT-PCR驗證。

（1）cDNA第一條鏈的合成。以牦牛乳中提取的Total RNA為模板，按試劑盒推薦方法進行操作，將所有液體離心混勻后放置于PCR儀上，在37℃（15 m in），85℃5s條件下反轉錄，反轉錄得到的cDNA保存于-20℃。如表2所示。

（2）PCR擴增。對反轉錄所得的cDNA進行PCR擴增。擴增程序為94℃預變性5 m in；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，從第二步開始進行33個循環；72℃延伸7 m in。取4μL擴增產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。RT-PCR擴增產物保存于-20℃。如表2所示。

表2 RT-PCR反應液

2 結果與分析

2.1 不同溫度下加熱總RNA的質量濃度和純度變化

不同溫度下加熱30m in后牦牛乳中總RNA的提取結果如表3所示。由表3可以看出，隨著處理溫度的逐漸升高，牦牛乳中總RNA的質量濃度逐漸降低，80℃和90℃處理的牦牛乳中總RNA的純度較其它溫度有明顯降低。不同溫度下處理的牦牛乳中總RNA的質量濃度和純度都存在顯著差異，其中70℃和80℃處理的牦牛乳中總RNA的質量濃度沒有顯著差異，新鮮牦牛乳和60℃、70℃處理的牦牛乳中總RNA的純度沒有顯著差異。

2.2 不同月份采集的牦牛乳總RNA的質量濃度和純度變化

2016年不同月份采集的牦牛乳分別保存不同的時間后提取的總RNA結果如表4所示。由表4可以看出，-20℃分別保存360，330，300，270，240，210 d后的牦牛乳中總RNA的質量濃度和純度與新鮮牛乳都存在顯著差異。

表3 不同溫度加熱30m in后牦牛乳中總RNA的質量濃度和純度

表4 2016年不同月份采集經保存后的牦牛乳中總RNA的質量濃度和純度

2.3 不同加工形式總RNA的質量濃度和純度

不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的提取結果如表5所示。由表5可以看出，與新鮮未處理的牦牛乳相比，牦牛乳凍干粉與牦牛乳酪的總RNA質量濃度濃度大幅度下降，分別下降了24.45 ng/μL和22.9 ng/μL，純度分別下降了0.27和0.25。不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的質量濃度和純度都存在顯著差異，其中牦牛乳干粉和牦牛乳酪中總RNA的質量濃度和純度沒有顯著差異。

表5 不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的質量濃度和純度

2.4 不同的處理方式總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

不同的處理方式及加工形式后提取牦牛乳中總RNA，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在溫度為40，50，60，70，80，90℃時，對牦牛乳加熱30 m in后提取的牦牛乳中總RNA未見其RNA的電泳條帶；2016年4，5，6，7，8，9月采集的牦牛乳保存至2017年4月后提取的牦牛乳中總RNA未見其RNA的電泳條帶；不同的加工形式即牦牛乳凍干粉和牦牛乳酪中總RNA也未跑出RNA的電泳條帶，與之前的研究結果保持一致[16]。

2.5 不同溫度下加熱后牦牛乳中總RNA的RT-PCR

以不同溫度處理的牦牛乳中總RNA為模板，對基因SCD 1進行RT-PCR擴增后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳顯示，40，50，60，70℃加熱30 m in的牦牛乳中SCD 1基因在181 bp處出現明顯的特異性條帶，且條帶清晰整齊，能滿足對牦牛乳中基因進行表達量研究的需要。80℃和90℃加熱30m in后的牦牛乳中SCD 1基因條帶暗，不能滿足對牦牛乳中基因表達研究的需要。

圖1 不同溫度下加熱30min后牦牛乳中SCD1基因的RT-PCR

2.6 不同月份采集的牦牛乳中總RNA的RT-PCR

以2016年不同月份采集并保存一定時間的牦牛乳總RNA模板，對基因SCD 1進行RT-PCR擴增后電泳顯示，不同月份采集且保存不同時間的牦牛乳SCD 1基因在181 bp處出現明顯的特異性條帶，且條帶清晰整齊。牦牛乳在-20℃保存了長達一年后，還可以滿足對牦牛乳中基因進行表達分析的需要。

圖2 2016年不同月份采集的牦牛乳保存一定時間后牦牛乳中SCD 1基因的RT-PCR

2.7 不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的RT-PCR

對牦牛乳進行不同形式的加工后以牦牛乳制品中的總RNA為模板，對基因SCD 1基因進行擴增后跑電泳，牦牛乳凍干粉SCD 1基因在181 bp處出現明顯的特異性條帶，且條帶清晰整齊，可以滿足對牦牛乳中基因進行表達量分析的需要。但牦牛乳酪SCD 1基因條帶暗，不能滿足對牦牛乳中基因表達研究的需要。

2.8 Agilent 2100檢測牦牛奶凍干粉RNA的完整性

利用Agilent 2100，檢測放置于-20℃冰箱保存一年的牦牛奶凍干粉的RNA完整性，結果如圖4。通常認為，R IN值＞7的標本適用于高質量的RNA研究，如基因芯片檢測；R IN值為4～7時，可以用于一般的分子生物學研究，如RT-PCR；當R IN＜4時，會嚴重影響分子生物學的試驗結果[22]。-20℃保存了一年的牦牛奶凍干粉中RNA的R IN值為6.3且在18/28s位

圖3 不同加工形式的牦牛乳制品中SCD1基因的RT-PCR

圖4 牦牛奶凍干粉的RNA完整性檢測

置出現明顯的峰，可用于進行后續的基因定量測定。

結果表明：不同的處理方式及加工形式會對牦牛乳中的rRNA產生影響，但m RNA會比較穩定的存在，有研究發現部分m RNA存在于外泌體中[23]，外泌體 能 夠攜 帶 微小 RNA（m icroRNAs，m iRNAs)，RNA，蛋白質等生物活性分子，并保護其免遭降解[24-25]，牦牛乳中的m RNA可以穩定存在，可能是由于外泌體的保護。由于cDNA文庫構建、基因克隆和基因表達分析等許多后續分子生物學操作都需要完整的m RNA[26]，因此可以利用牦牛乳及乳制品中的m RNA進行后續的基因研究，解決了采集牛乳腺組織和肝臟樣品費時費力的問題，有利于牦牛動物福利，是一種較好的非浸染方法。并且通過設計特異常性引物，進行PCR擴增可以鑒別牦牛乳的摻假[27]，為牦牛乳的摻假檢測提供新的思路。

3 結論

研究了牦牛乳不同的處理方式及加工形式對其總RNA的純度及完整性的影響，在40，50，60，70，80，90℃加熱30 m in后會對牦牛乳中總RNA的質量濃度與純度產生一定的影響；2016年4～9月采集的牦牛乳保存至2017年4月后對牦牛乳中的總RNA的質量濃度與純度都有一定的影響；牦牛乳凍干粉和牦牛乳酪中的總RNA的質量濃度和純度較新鮮牦牛乳相比都有大幅度下降。

對上述不同的處理方式及加工形式提取出的牦牛乳中總RNA跑電泳時發現，所有的處理方式及加工形式均未見其RNA的電泳條帶，但在對提取的總RNA進行SCD 1基因的RT-PCR時，溫度為40，50，60，70℃加熱30m in后的牦牛乳，2016年不同月份采集的牦牛乳并保存一定時間后的牦牛乳，以及牦牛乳凍干粉的SCD 1基因均跑出了條帶，條帶清晰整齊，滿足了對牦牛乳進行后續基因研究的需要。并且對-20℃保存了一年的牦牛奶凍干粉中RNA的完整性檢測，發現RNA仍滿足后續對牦牛乳基因表達研究的要求。

參考文獻：

[1]卞茂紅,張循善,程越,等.人RHD基因的克隆和鑒定[J].中國微生態學雜志,2008,20(6):575-576.

[2]MONIKA K,ANITA K,ARTUR M,et al.Evaluation of different RNA extraction methods for high-quality total RNA and m RNA from Erwinia amylovora in planta[J].Eur J Plant Pathol,2016,146:893-899.

[3]胡小蓉,馬燕,臧德奎,等.芍藥芽總RNA提取方法的研究[J].山東農業科學,2015,(02):16-20.

[4]顧廣發,李勇,任維琰,等.餐廚垃圾資源化技術研究探討術[J].環境衛生工程,2011,19(3):1-3.

[5]JIANG Z,UBOH C E,CHEN J,etal.Isolation of RNA from equine peripheral blood cells:comparison of methods[J].Springer plus,2013,2:478.

[6]BECKER C,HAMMERLE-FICKINGER A,RIEDMAIER I,et al.m RNA and micro RNA quality control for RT-qPCR analysis[J].Methods,2010,50:237-243.

[7]S FLEIGE M WPFAFFL.RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance[J].Molecular Aspects of Medicine,2006,27:126-139.

[8]史紅鴿,戚元成,申進文.一種從平菇菌絲中提取總RNA的方法[J].江西農業學報,2014(8):68-70.

[9]張杰,武晶晶,趙飛飛,等.不同溫度和不同放置時間對總RNA提取濃度和純度的影響[J].實驗技術與管理,2013(11):79-82,86.

[10]宋艷波,梅霞,吳國良,等.核桃芽總RNA提取及RT-PCR[J].農學學報,2012,(07):25-28,54.

[11]周向紅,易樂飛,王萍.桑椹總RNA抽提方法的比較[J].食品科學,2011(12):209-212.

[12]易樂飛,穆亮亮,仲改.凡納濱對蝦總RNA完整性的正確評估[J].浙江農業學報,2016,(12):2007-2013.

[13]江莎,孟凡,周振雷,等.熒光Real-time PCR鑒定雞胸骨總RNA質量[J].生物學雜志,2012,29(5):92-95.

[14]王玉成,張國棟,姜靜.一種適用范圍廣的總RNA提取方法[J]．植物研究,2006,26(1):84-87.

[15]WA NG T,ZHANG N,DU L.Isolation of RNA of high quality and yield from inkgo biloba leaves[J].Biotechnol Lett,2005,27(9):629-633.

[16]LIH M,MA Y,LIQ M.The chem ical composition and nitrogen distribution of Chinese yak(Maiwa)milk[J].International Journal of Molecular Sciences,2011,12(8):4885-4895.

[17]侯雙利,劉翠晶,楊利民,等.影響植物組織總RNA質量的因素[J].人參研究,2013(2):11-16.

[18]劉冬,黃玉軍,趙海晴,等.牦牛乳蛋白質組成及特性[J].乳業科學與技術,2013(3):20-23.

[19]H IZUM IN KOSAKA T SHIM IZU etal.Bovine milk contains micro RNA and messenger RNA that are stable under degradative conditions[J].J.Dairy Sci,2012,95:4831-4841.

[20]吳新穎,李鈺金,郭玉華,等.真空冷凍干燥技術在食品工業中的應用[J].肉類研究,2010(1):75-78.

[21]楊曉燕,張波,黃方愛,等.葡萄葉片中提取總RNA的三種方法比較[J].北方園藝,2013(2):87-90.

[22]張佳年,計駿,劉炳亞,等.深低溫凍存胃癌樣本的核酸與蛋白質質量控制研究[J].中國腫瘤臨床,2016,(01):27-34.

[23]VALADIH,EKSTROM K,BOSSIOSA,et al.Exosome-mediated transfer ofmRNAsand microRNAs isa novelmechanism of genetic exchangebetween cells[J].Nat.CellBiol,2007,9:654–659.

[24]張敏,張晨光,丁衛.外泌體及其在腫瘤診療中的意義[J].生理科學進展,2014,(05):372-378.

[25]ARROYO JD,CHEVILLET JR,KROH EM,et al.Argonaute 2 complexes carry a population of circulating micro RNAs independent of vesicles in human plasma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(12):5003-5008.

[26]周向紅,易樂飛,王萍.桑椹總RNA抽提方法的比較[J].食品科學,2011,(12):209-212.

[27]陳沁,徐仙,姚麗萍.牛乳摻豆漿和乳粉的PCR檢測[J].生物技術通報,2010,(05):162-165,178.