高效液相色譜法測定人體外周血丙戊酸鈉濃度

孫玉花 葉延芬（通訊作者） 袁會成 趙良存

（甘肅省武威腫瘤醫(yī)院 甘肅 武威733000）

丙戊酸鈉為廣譜抗癲癇藥，其抗癇譜廣、療效高，是較理想的抗癲癇藥物。近年來，臨床用于治療偏頭痛、原發(fā)性三叉神經(jīng)痛、遲發(fā)性運動障礙等也有較好療效[1-2]，但其在臨床上的治療指數(shù)低，安全有效血藥濃度范圍較窄，而且服藥周期長，容易發(fā)生不良反應[3]。患者長期服用丙戊酸鈉治療的過程中，密切注意影響丙戊酸鈉血藥濃度波動的因素，必須綜合考慮各方面的因素，實行個體化給藥，以血藥濃度為依據(jù)，而確保患者的用藥安全。本法通過優(yōu)化血漿中丙戊酸鈉提取方法，減少干擾因素，通過HPLC法測定腫瘤患者血漿中丙戊酸鈉的含量，其專屬性強、結果可靠，為臨床使用丙戊酸鈉做好藥學監(jiān)護提供了依據(jù)。

1.儀器與試藥

LC100高效液相色譜儀（上海伍豐科學儀器有限公司）；BSM電子天平（上海卓精電子科技有限公司），HX-03超聲波清洗器（武漢恒信世紀科技有限公司）。

丙戊酸鈉對照品由中國食品藥品生物制品檢定研究所提供（批號：100963-201302）；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；正己烷、甲醇、三乙胺均為分析純；空白血漿由血庫供應。

2.試驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：PronaosEP-C18柱（4.6mm×250mm）；流動相：乙腈-水（75:25）[1]，流速：1.0mL?min-1，柱溫：35℃，檢測波長：248nm；理論板數(shù)應不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的丙戊酸鈉對照品57.5mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得1.15mg?mL-1丙戊酸鈉對照品溶液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣品處理方法

精密吸取待測血清樣品180μL于10mL試管中，加20μL甲醇，振搖混勻，加入1mol/L硫酸200μL，再加入正己烷5mL，旋渦振蕩2min，取上清液至試管中，加入10g/L α-溴苯乙酮200μL，10%三乙胺50μL，超聲2min，置55℃水浴中衍生化反應15min，揮干有機溶劑，殘渣用乙腈200μL溶解，0.45μm濾膜濾過，取20μL進樣。

2.4 對照樣品處理

取健康人血清180μL于10mL小試管中，加入丙戊酸鈉對照品溶液20μL，振搖混勻，加入1mol/L硫酸200μL，按照“2.3”項下處理，取20μL進樣。

3.結果

3.1 色譜行為

空白血清、空白血清加丙戊酸鈉對照品、待測血清樣品色譜圖見圖1。由圖可見在此色譜條件下丙戊酸鈉的色譜峰能夠完全分離，峰形對稱，無雜質峰干擾，丙戊酸鈉對照品的保留時間為12.86min，樣品保留時間為12.76min。

3.2 線性關系考察

精密量取對照品貯備液1、2、4、6、8、10mL，分別加入10mL量瓶中，加流動相稀釋制成0.115、0.230、0.46、0.69、0.92、1.15mg?mL-1對照品溶液，搖勻，分別精密量取20μL加入6只5mL具塞試管中，加健康人血清150μL。按照“2.3”項下處理，取20μL進樣，以丙戊酸鈉濃度（X）與丙戊酸鈉峰面積（Y）進行線性回歸得回歸方程：Y=12.4235X-1.2536(r=0.9999)。結果表明：丙戊酸鈉濃度（X）為11.5～115μg?mL-1間呈良好線性關系。

3.3 精密度考察

分別配制11.5、46、115μg/mL 3種濃度的對照品+血清各5份，置于5mL具塞試管中，按照“2.3”項下處理，分別于1d內連續(xù)檢測5次及5d內每天檢測1次，記錄峰面積。計算日內和日間精密度，結果見表1。

表1 血清中丙戊酸鈉的精密度（n=5，±s）

表1 血清中丙戊酸鈉的精密度（n=5，±s）

樣品中丙戊酸鈉含量（μg/mL）日內精密度 日間精密度檢測值（μg/mL）RSD（%） 檢測值（μg/mL） RSD（%）11.511.44±0.0712.4211.38±0.142.71 46.045.86±0.841.0846.12±0.981.42 115.0115.5±0.680.61114.97±1.261.05

3.4 回收率考察

分別配制11.5、46、115μg/mL3種濃度的對照品血清樣品各5份，按照“2.3”項下處理，測定色譜峰面積，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗結果（n=5，±s）

表2 回收率試驗結果（n=5，±s）

加入丙戊酸鈉對照品量（μg/mL） 檢出量（μg/mL） 相對回收率（%）RSD（%）11.511.55±0.1698.262.62 4645.68±0.8599.351.12 115113.68±1.2199.471.34

3.5 穩(wěn)定性考察

取丙戊酸鈉貯備液，用流動相分別配制成11.5、46、115μg/mL3種濃度的對照品血清樣品溶液，于4℃冰箱保存，分別在0、1、3、5d進樣，記錄峰面積，三種不同濃度丙戊酸鈉的照片峰面積的RSD分別為1.05%、1.84%、2.21%，n=4。表明丙戊酸鈉對照品溶液在5天內穩(wěn)定。

4.討論

4.1 丙戊酸鈉為一種不含氮有機酸鹽，有效血藥濃度為50～100μg/mL，血藥濃度超過100μg/mL，毒副作用增加療效無明顯增加[4]，主要引起血清堿性磷酸酶和氨基轉移酶升高，倦睡、眩暈、疲乏、頭痛、共濟失調、輕微震顫、異常興奮、不安和煩躁等反應[5]，因此在用藥過程中檢查血藥濃度來為臨床治療提供依據(jù)。

4.2 目前，有關丙戊酸鈉在人體血漿中濃度檢測方法主要采用熒光偏振免疫分析法（FPIA），其精密度與準確度均較高，在臨床抗癲癇治療中，可有效的指導臨床合理用藥，但FPIA法儀器設備昂貴，各醫(yī)療機構FPIA不能普遍使用，部分欠發(fā)達地區(qū)的用藥人群不能提供藥學監(jiān)護，本文丙戊酸鈉藥物濃度測定方法為有關資料[6-7]報道的高效液相色譜法，用α-溴苯乙酮柱前衍生化反應，丙戊酸鈉的保留時間和分離效果比較理想。

4.3 丙戊酸鈉經(jīng)柱前衍生化后與血漿中其他成分分離效果好，其他成分對測定無干擾，有文獻報道[8]，HPLC法檢測結果略高于FPIA法，我們采用HPLC法和FPIA法進行檢測比較，兩種方法無顯著差異，本文HPLC法樣品處理步驟簡便、方法簡單、重復性好、結果準確，適用于丙戊酸鈉的血藥濃度測定及臨床藥代動力學研究。

【參考文獻】

[1]陳新悅.丙戊酸鈉的臨床新用途[J].中國農(nóng)業(yè),2006,15(10):62.

[2]劉智.丙戊酸鈉治療精神病患者的攻擊行為[J].重慶醫(yī)學，2007,36:490-491.

[3]朱斌.1214例丙戊酸血藥濃度監(jiān)測的回顧性分析[J].藥物流行病學雜志,2008,17:48-49.

[4]王宏虹.丙戊酸鈉血藥濃度監(jiān)測研究概況[J].齊魯藥事，2012,31:10.

[5]何思陸.丙戊酸鈉致不良反應39例文獻分析[J].中國藥房，2010,21:40.

[6]陳艷，袁君.柱前衍生HPLC法測定丙戊酸鈉的血藥濃度及其臨床應用[J].安徽醫(yī)藥，2010,14:289-290.

[7]馮惠平，陳宜峰.柱前衍生-高效液相色譜法測定人血清中丙戊酸鈉的濃度[J].中國藥師，2009,12:1755-1757.

[8]張浩，李金德.FPIA法與HPLC法監(jiān)測癲癇患兒外周血丙戊酸鈉濃度差異的比較[J].中國生化藥物雜志，2017,1:37.