高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定雞蛋中氯霉素殘留量的不確定度評定

◎ 黃偉蓉，張朋杰，張憲臣，陳麗斯，楊 蕙，盧俊文，陳潤雯

（中山海關(guān)技術(shù)中心，廣東 中山 528400）

氯霉素是一種廣譜性抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有良好的抑制作用，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)菌感染的臨床治療；但也能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺失癥、新生兒灰色綜合癥等[1-2]；因此食品中氯霉素的殘留會(huì)對人體健康造成嚴(yán)重危害。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235 號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》將氯霉素列入禁用藥，其檢測限為 0.1 μg·kg-1。我國規(guī)定在雞肉中的殘留限量為100 μg·kg-1，這一限度不會(huì)引起骨髓抑制或再生障礙性貧血，但對胚胎有毒性，妊娠動(dòng)物禁用，產(chǎn)蛋雞禁用，在雞蛋中不得檢出[3]。雞蛋也是動(dòng)物源性食品的重要部分，因此準(zhǔn)確測定雞蛋中氯霉素的殘留量具有重要意義。而不確定度的大小直接反應(yīng)了測量水平的高低，對質(zhì)量控制具有重要意義；因此為了檢測檢測結(jié)果的可信度，本研究參考了GB/T 22338-2008《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》中的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測雞蛋中的氯霉素殘留量，并根據(jù)CNAS-GL 06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[4]，JJF 1059.1-2012《測量不確定度與表示》[5]及JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[6]等相關(guān)指導(dǎo)性文件，建立了一套合理、完整的雞蛋中氯霉素殘留量的不確定度評估方案[7-11]。

1 儀器與試劑

AB Sciex Triple Quad 5500 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜：配電噴霧離子源（ESI）（美國AB 公司）；天平 HF-2 000，感量0.01 g；Sartorius BSA2245，感量0.000 1 g。 攪拌機(jī)、振蕩器、離心機(jī)、氮吹儀、移液器（100 μL、200 μL、100 μL）以及100 mL 容量瓶，A 級。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.24%；氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)，純度≥99.9%。乙酸乙酯，甲醇，正己烷：色譜純；無水硫酸鈉、氨水：分析純；0.22μm 有機(jī)相濾膜；實(shí)驗(yàn)室一級水。

2 方法

2.1 樣品的選擇和制備

從市場購買1 kg 鮮雞蛋作為試樣。取鮮雞蛋約500 g，去殼經(jīng)高速組織攪拌機(jī)均勻搗碎混勻，裝入潔凈容器，密封，待測定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

濃度為100 μg·mL-1的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：按純度折算準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 0 g，置于100 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解稀釋并定容至刻度，搖勻。

濃度為1 μg·mL-1的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液：用移液器準(zhǔn)確移取濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL 至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

濃度為5 ng·mL-1的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液：用移液器準(zhǔn)確移取濃度為1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液0.5 mL 至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取攪拌均勻的雞蛋樣品5 g（精準(zhǔn)至0.01 g）置于50 mL 離心管，依次加入15 mL 乙酸乙酯，0.5 mL 氫氧化銨，5 g 無水硫酸鈉，振搖10 min，4 500 r·min-1離心10 min，吸取上清液到另一50 mL 離心管中。另取15 mL 乙酸乙酯和0.5 mL 氫氧化銨溶解殘?jiān)?，重?fù)提取一次。將兩次提取液合并，并渦旋混勻。取6 mL提取液于氮吹管中在50 ℃下吹至近干，加2 mL 水溶解，溶解后加3 mL10%甲醇飽和正己烷渦旋混合， 4 500 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用10%甲醇飽和正己烷重復(fù)凈化一次。取下層過0.2 μm 濾膜供高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀。

3 儀器條件

3.1 色譜條件

色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm）；流動(dòng) 相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫條件：0 ～2 min， 25%A；2 ～4 min，80%A；4 ～6 min，25%A； 流 速0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式采集；噴霧電 壓：-4 500 V；氣簾氣流速：30 L·min-1；錐孔氣流速：45 L·min-1；去溶劑氣流速：50 L·min-1；多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）。

4 建立不確定度數(shù)學(xué)模型

氯霉素不確定度數(shù)學(xué)模型為：

式（1）中：X-試樣中氯霉素的殘留量，μg·kg-1； c-由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中氯霉素的濃度，ng·mL-1；V-試樣的最終定容體積，mL；m-樣品稱樣量，g；R-回收率校正因子；fr-LC-MS/MS 儀器的校準(zhǔn)因子。

5 不確定度分量的主要來源及其分析

從測量過程和數(shù)學(xué)模型分析，測量不確定度的主要來源為：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的不確定度，試樣稱量引入的不確定度，試樣最終定容體積引入的不確定度，試樣重復(fù)測定引入的不確定度，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度，LC-MS/MS 儀器定量校準(zhǔn)引入的不確定度，樣品提取凈化過程引入的不確定度（以回收率表示）。

針對不同的不確定度來源進(jìn)行A 類與B 類評定分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中隨機(jī)分布和接近正態(tài)分布的情況，重復(fù)測量試樣并獲得一組測量值及標(biāo)準(zhǔn)差和使用檢定證書、校正證書及儀器的準(zhǔn)確度等級等數(shù)據(jù)作為測量不確定度的分量，利用貝賽爾法進(jìn)行分析并求出標(biāo)準(zhǔn)不確定度和標(biāo)準(zhǔn)相對不確定度，進(jìn)而求出合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。

5.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度

根據(jù)B 類評定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出的純度為99.24%±0.77%，按照均勻分布計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對不確定度為：

5.2 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

根據(jù)B 類評定，天平Sartorius BSA2245 的檢定證 書，感量為0.000 1 g，稱取0.010 0 g 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照均勻分布計(jì)算，其相對不確定度為：

5.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的不確定度

5.3.1 配制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液產(chǎn)生的不確定度

準(zhǔn)確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 0 g，置于100 mL的容量瓶中，用甲醇超聲溶解稀釋并定容至刻度。根據(jù)JJG-196-2006《常用玻璃器具檢定規(guī)程》，A 級 100 mL 容量瓶的最大允許誤差為±0.10 mL，按均勻分布計(jì)算，其相對不確定度為：

實(shí)驗(yàn)室溫度為（20±5）℃，甲醇的膨脹系數(shù)為1.18×10-3℃-1，以20 ℃時(shí)1 mL 體積作為校準(zhǔn)，按均勻分布計(jì)算，由溫度引入的相對不確定度為：

因此配制濃度為100 μg·mL-1氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液所引入的合成相對不確定度為：

5.3.2 配制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液產(chǎn)生的不確定度

配制過程中使用到100 mL 容量瓶和1 000 μL 的單道移液器。

使用量程為1 000 μL 的單道移液器移取1 mL 時(shí)的精度等級為±0.6%（儀器商提供），假設(shè)均勻分布，移液器引入的相對不確定度為：

實(shí)驗(yàn)室溫度為（20±5）℃，甲醇的膨脹系數(shù)為1.18×10-3℃-1，溫度引入的相對不確定度為：

移液器吸取1 mL 引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

JJG-196-2006《常用玻璃器具檢定規(guī)程》規(guī)定，A級100 mL 容量瓶的最大允許誤差為±0.10 mL，按均勻分布計(jì)算，其相對不確定度為：

實(shí)驗(yàn)室溫度為（20±5）℃，甲醇的膨脹系數(shù)為1.18×10-3℃-1，以20 ℃時(shí)1 mL 體積作為校準(zhǔn)，按均勻分布計(jì)算，由溫度引入的相對不確定度為：

因此配制濃度為1 μg·mL-1氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)中間液所引入的合成相對不確定度為：

所以1μg·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過程中所引入的合成相對不確定度為：

5.3.3 配制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度

配制過程中使用到100 mL 容量瓶和1 000 μL 的單道移液器。

使用量程為1 000μL 的單道移液器移取0.5 mL 時(shí)的精度等級為±0.8%（儀器商提供），假設(shè)均勻分布，移液器引入的不確定度為：

其他指標(biāo)與5.3.2 一致，移液器吸取0.5 mL 引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

根據(jù)JJG-196-2006《常用玻璃器具檢定規(guī)程》，A級100 mL 容量瓶的最大允許誤差為±0.10mL，按均勻分布計(jì)算，其相對不確定度為：

其他指標(biāo)與5.3.2 中一致，由溫度引入的相對不確定度為：

因此配制濃度為5 ng·mL-1的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液所引入的合成相對不確定度為：

所以濃度5ng·mL-1氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中所引入的合成相對不確定度為：

綜上所述，所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制過程中所引入的合成相對不確定度為：

5.4 試樣稱量引入的不確定度

雞蛋樣品稱樣量為5.00 g，所用天平為HF-2000，在0 ～500 g 稱量范圍內(nèi)的最大允許誤差為±0.01 g，按均勻分布評定，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

5.5 試樣最終定容體積引入的不確定度

使用量程為5 mL 的移液器移取2 mL 水溶解殘?jiān)?，精度等級為?.8%（儀器商提供），假設(shè)均勻分布，移液器引入的相對不確定度為：

水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，以20 ℃時(shí)1 mL 體積作為校準(zhǔn)，試驗(yàn)溫度變化范圍為（20±5）℃，按均勻分布計(jì)算，由溫度引入的相對不確定度為：

所以，樣品定容體積產(chǎn)生的相對不確定度為：

5.6 試樣重復(fù)測定所引入的不確定度

在相同的條件下對樣品重復(fù)測定6 次，測量結(jié)果見表1。

樣品測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為（共測量6 次，p=6）：

表1 樣品中氯霉素殘留測定結(jié)果表

則A 類標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此重復(fù)測量樣品引入的相對不確定度為：

5.7 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式如式（28）：

式（28）中：sb為標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)信號(hào)殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算公式如式（29）：

式（28）（29）中：b 為回歸方程斜率；m 為試樣中待測物含量的測定次數(shù)；n 為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)；x-為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的平均值；x-0為待測物平均濃度；xi為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度測定值；yi為是相對于xi的測定值。標(biāo)準(zhǔn)曲線包含6 個(gè)濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度點(diǎn)測定2 次，擬合曲線方程為y=1.23x-0.029 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3 見表2，待測樣品測定6 次的平均濃度值x-0=0.252 ng·mL-1，結(jié)果見表1。所以由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為：U(curve)=0.005 55，相對不確定度為：

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算結(jié)果表

5.8 LC-MS/MS 儀器定量校準(zhǔn)引入的不確定度

根據(jù)B 類評定、儀器檢定證書，儀器定量重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%，按均勻分布，儀器定量校準(zhǔn)引入的不確定度為：

5.9 樣品提取凈化過程引入的不確定度

樣品提取凈化過程的不確定度用樣品回收率的不確定度表示，選取回收率添加水平為0.25 μg·kg-1， 平行測定6 個(gè)加標(biāo)回收樣品，回收率（R）分別為98.8%、100.0%、97.6%、106.8%、95.6%以及105.2%， 平均回收率（）為100.7%?；厥章实臉?biāo)準(zhǔn)偏差為：

根據(jù)A 類標(biāo)準(zhǔn)分布計(jì)算樣品提取凈化過程引入的不確定度為：

因此樣品提取凈化過程引入的不確定度：

5.10 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)以上分析及A 類評定方法，列出相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表（見表3）。

表3 各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

雞蛋中氯霉素殘留量平均值為0.493μg·kg-1，因此測定過程中合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(x)=urel(X)×=0.0412×0.493=0.0203 μg·kg-1（36）

擴(kuò)展不確定度：選擇置信度為95%，k=2，則擴(kuò)展不確定度為U=0.020 3×2=0.040 6 μg·kg-1，雞蛋中氯霉素殘留量結(jié)果為（0.493±0.040 6）μg·kg-1。

6 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對雞蛋樣品中氯霉素殘留量進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，當(dāng)雞蛋樣品中殘留量為0.493 μg·kg-1時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為U=0.020 3×2=0.040 6 μg·kg-1。測量結(jié)果準(zhǔn)確度較高，適用于雞蛋中氯霉素的殘留檢測。通過表3 可知，實(shí)驗(yàn)過程中引入的不確定度對檢測結(jié)果影響較大的主要分量有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制、樣品重復(fù)測定、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、儀器定量校準(zhǔn)；而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量、樣品稱重質(zhì)量、最終定容體積、樣品回收率等過程引入的不確定度分量對檢測結(jié)果影響相對較小。因此在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)調(diào)整儀器使之達(dá)到最佳狀態(tài)，制備樣品時(shí)使樣品充分均勻，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、穩(wěn)定及可靠。