快速檢測技術在醬油發酵中微量乙醇含量測定的應用改進

莫允煥，薛健長，曾小波

(李錦記(新會)食品有限公司，廣東 江門　529156)

目前，對于微量乙醇的測定主要以氣相色譜法為主，但檢測儀器投入大，檢測成本高，制約了此方法的廣泛應用。重鉻酸鹽氧化分光光度法測定微量乙醇含量，是一種快速、準確的測定方法，它具有操作簡便、所需分析儀器簡單的特點，尤其適用于生產和質檢部門的日常分析。而隨著科技的發展，更多的檢測儀器、檢測手段的應用，是否有更快捷、更簡單的檢測方法呢？

在《中國藥典2005版一部》附錄Ⅸ M 乙醇量測定法Ⅱ中提及了蒸餾法的測定，是對樣品進行蒸餾后獲得乙醇餾出物進行相對密度的測定，從而折算出乙醇的含量[1]。此方法在應用儀器、檢測步驟、檢測時間上具備優勢，符合企業生產檢測需求。

1　材料和方法

通過氣相色譜法(第一法)、重鉻酸鹽氧化分光光度法、蒸餾測量相對密度法測量發酵醬油中微量乙醇含量的實驗過程和數據結果，得出企業實際應用的最優檢測方案。

1.1　材料和試劑

典型廣式醬油和日式醬油：由李錦記(新會)食品有限公司提供。

乙醇(無水乙醇)：廣州化學試劑廠。

1.2　儀器和設備

GC-2010 Plus氣相色譜儀日本島津公司；紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；凱氏定氮儀德國福斯分析儀器公司；DMA4500M密度計奧地利安東帕公司；電爐、電磁爐、蒸餾回流設備、容量瓶等常用實驗室儀器廠家。

1.3　方法

1.3.1氣相色譜法測定乙醇含量

氣相色譜法應用范圍廣，國家標準已將氣相色譜法列為啤酒、葡萄酒、果酒中酒精度的測定方法之一[2,3]；氣相色譜法測定藥酒中的乙醇量[4]；氣相色譜法測定果蔬汁飲料、含乳飲料中的乙醇含量[5]；氣相色譜法測定消毒劑中的乙醇含量[6]；中國藥典中酒精度的測定已將氣相色譜法列為第一分析法。

氣相色譜法測定乙醇含量主要應用外標法定量。用欲測組分的純物質加稀釋劑(對液體試樣用溶劑稀釋，氣體試樣用載氣或空氣稀釋)配制成不同質量分數的標準溶液，取固定量標準溶液進行分析，從所得色譜圖上測得相應信號(峰面積或峰高)，然后繪制響應信號(縱坐標)對質量分數(橫坐標)的標準曲線，見圖1。分析時，取和繪制標準曲線時同樣量的試劑(固定量進樣)，測得該試樣的響應信號，由標準曲線即可查出其質量分數[7]。

圖1　氣相色譜乙醇濃度標準曲線Fig.1 Standard curve of ethanol concentration by gas chromatography

用外標法進行定量具有不使用校正因子、操作簡單、計算方便等優點，但是這種方法結果的準確度主要取決于進樣量的重現性和操作條件的穩定性，且檢測儀器(色譜儀)投入大，檢測成本高。

1.3.2分光光度法測定乙醇含量

重鉻酸鹽氧化分光光度法測定微量乙醇含量，是一種快速、準確的測定方法，它具有操作簡便、所需分析儀器簡單的特點，適用于生產和質檢部門的日常分析。

在酸性溶液中，乙醇可被重鉻酸氧化生成乙酸，重鉻酸鉀中的六價鉻被還原成三價鉻，其反應式為：

3C2H5OH+2K2Cr2O7+8H2SO4=3CH3COOH+2K2SO4+2Cr2(SO4)+11H2O。

反應中生成的三價鉻為綠色，它在585 nm處有最大吸收峰，且溶液顏色的深淺與乙醇含量成正比，可以在分光光度計上比色，通過與標準系列比較進行定量[8,9]。

取6支25 mL A級比色管，各加入1 mL重鉻酸鉀溶液和5 mL濃H2SO4，混勻，并冷卻，依次加入表1中的溶液。

表1　標準溶液配制Table 1 The preparation of standard solution

搖勻，于沸水浴中保溫發色10 min，取出冷卻至常溫，于600 nm波長處分別測定其吸光度，繪制標準曲線，測得的結果見表2。

表2　標準溶液對應吸光度Table 2 The absorbance of standard solution

由表1和表2繪制成標準曲線，見圖2。

圖2　分光光度法乙醇濃度標準曲線Fig.2 Standard curve of ethanol concentration by spectrophotometry

取50 mL 樣品置入500 mL圓底燒瓶中，加150 mL蒸餾水，連接好冷凝裝置(檢查出水管是否暢通，保證冷卻水進出自如)后蒸餾，用50 mL容量瓶(接收容量瓶用冰粒冷卻)準確接收餾出液50 mL，搖勻。根據樣品大概酒精含量以倍數(N)稀釋餾出液(0～0.1%不稀釋；0.1%～1% 稀釋10倍；1%～10%稀釋50倍；10%～30%稀釋100倍)。吸取5 mL稀釋液置入25 mL比色管中，加 1 mL 2%重鉻酸鉀溶液、5 mL濃硫酸，搖勻，于沸水浴中保溫發色10 min，取出冷卻。600 nm波長處分別測定其吸光度，代入標準曲線方程求得乙醇含量。

用分光光度法進行定量的測定方法具有操作簡便、所需分析儀器簡單的特點。但是這種方法結果容易受試劑變化所影響，因此每次新配試劑均需重新制定標準曲線，且檢測時間相對較長[10]。

1.3.3蒸餾法測定相對密度換算成乙醇含量

以蒸餾法去除樣品中的不揮發性物質，再測量餾出液的相對密度，換算成乙醇含量[11-14]。

1.3.3.1蒸餾

依照分光光度法測定的蒸餾步驟，使用蒸餾瓶連接冷凝裝置接出餾出液，見圖3。

圖3　蒸餾裝置Fig.3 Distillation apparatus

使用凱氏定氮蒸餾儀，設定100 ℃，3 min，接出餾出液，見圖4。

圖4　凱氏定氮蒸餾儀Fig.4 Kjeldahl distillation apparatus

1.3.3.2相對密度

其原理是通過儀器內部的U型振蕩管密度計測量餾出液密度后換算成乙醇濃度，見圖5。

圖5　安東帕DMA4500MFig.5 Anton Paar DMA4500M

其中蒸餾方法①操作步驟多，玻璃儀器連接的氣密性對最終結果影響較大，相對時間長(約45 min/樣)；蒸餾方法②時間短(僅3 min)，且操作步驟少，可相應減少檢測過程誤差的產生。在嘗試蒸餾方法②時，乙醇標準液回收率檢測合格。但檢測我公司產品時，沸騰后會產生很多泡沫，溢出蒸餾罐，造成檢測結果的誤差。通過一系列嘗試，最終添加少量單硬脂酸甘油酯(食品級消泡劑)可避免此現象。

2　結果和分析

2.1　方法有效性驗證

氣相色譜法和分光光度法均收錄在國標檢測方法中，則此兩種方法不做相關回收率驗證。主要對蒸餾測相對密度法進行回收率驗證，用標準溶液驗證。計算儀器引起的偏差和檢測方法的偏差，以判斷方法的可行性，驗證數據見表3。

表3　標準溶液回收率結果Table 3 Recoveries of standard solution

再依據GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中關于回收率范圍的規定[15]，見表4。

表4　回收率范圍Table 4 The recoveries range

得出結論：配制濃度為0.1%的樣品檢測偏差超出回收率許可范圍，即此方法不適用于0.2%以下乙醇含量的樣品檢測。而0.2%標準溶液檢測結果的儀器和檢測方法偏差均較大，還需進一步驗證。

進行重復試驗以考察該方法的最低檢測限和方法的穩定性，數據見表5。

表5　最低檢測限和穩定性驗證Table 5 Minimum detection limit and stability verification

再依據GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中關于測定值與真值的偏差指導范圍的規定，見表6。

表6　測定值與真值的偏差指導范圍Table 6 Range of deviation between measured value and true value

配制濃度為0.5%以下的樣品檢測偏差超出偏差許可范圍，即此方法不適用于0.5%以下乙醇含量的樣品檢測。0.5%以上的結果偏差符合要求且穩定性較好。

最后進行實際應用驗證(發酵醬油產品加標回收)，具體數據見表7。

表7　加標回收測試Table 7 The recovery rate

同時考慮常規發酵醬油產品乙醇含量在1%～3%之間，因此該方法符合發酵醬油檢測無水乙醇的要求。

2.2　三種檢測方法的對比

2.2.1檢測成本對比

方法一儀器投入成本高，檢測時間長，每日(以8 h算)樣品處理量約6～8個；方法二儀器投入成本不高，且所用儀器(蒸餾設備、分光光度計等)為日常醬油檢測所用儀器，操作簡便。但是這種方法結果容易受試劑變化所影響，因此每次新配試劑均需重新制定標準曲線，且檢測時間相對較長，每日樣品處理量約20～30個；方法三儀器簡單，所用儀器(蒸餾設備、比重計等)為日常醬油檢測所用儀器。不需消耗化學試劑，每日樣品處理量約40～60個。

2.2.2檢測結果精密度對比

使用三種方法對相同樣品進行檢測對照，以氣相色譜法(第一分析法)檢測的樣品結果作為標準結果對分光光度法和蒸餾測相對密度法的結果進行比對，判斷后面兩種方法的精確度，結果見表8。

表8　結果對比Table 8 The results of comparison

由表8可知，蒸餾測相對密度法所得的樣品乙醇含量與氣相法所測結果較接近。

3　結論

微量乙醇的測定方法在我公司檢測樣品應用的發展，由最初氣相法測定的樣品檢測周期長、檢測成本高，優化到分光光度法檢測。而分光光度法檢測的操作步驟多、相對誤差大，最終開發應用了蒸餾測相對密度法。相比之下每次的方法改進都比之前的檢測更快捷方便，降低了檢測成本。同時，新方法的開發使用必須經過嚴謹的驗證。

其他檢驗方法在日常應用中也要與時俱進，食品檢驗人員必須具備相關學習應用和優化檢驗方法的技能。

參考文獻：

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[15]GB/T 27404-2008,實驗室質量控制規范 食品理化檢測[S].