紫蘇粕發(fā)酵生產(chǎn)腐乳的前發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

張昕,金和花,候兵斌,田家英*

(1.吉林工商學(xué)院糧油食品深加工吉林省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春　130507;2.吉林工商學(xué)院，長(zhǎng)春　130507)

紫蘇在我國(guó)種植廣泛，約有2000年的種植和食用歷史，主要用途為油用、藥用、香料。紫蘇學(xué)名(Perillafrutescens(L.)Britt.)，別名荏、紅蘇、香蘇、白蘇等，全株均有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。經(jīng)檢測(cè)，紫蘇種子中含有粗蛋白22.5%、粗脂肪38.8%、粗纖維17%左右，紫蘇油脂中ω-3系列多烯不飽和脂肪酸含量達(dá)60%以上[2]。紫蘇含有特殊的活性成分和營(yíng)養(yǎng)成分，包括紫蘇醛、薄荷酮、紫蘇醇、丁香油酚、超氧化物歧化酶(SOD)、維生素、磷脂等，使其具有獨(dú)特保健功能、藥用功能和香氣[3]。目前紫蘇籽加工的主要產(chǎn)品是紫蘇油，冷榨紫蘇油產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物紫蘇粕[4]，經(jīng)檢測(cè)，紫蘇粕中含有粗蛋白32%～38%、粗脂肪10%～13%、粗纖維約16%，蛋白質(zhì)含量較高。豆腐乳是深受人們喜愛(ài)的特色發(fā)酵食品,國(guó)人食用豆腐乳歷史悠久，傳統(tǒng)的豆腐乳生產(chǎn)工藝是以大豆為主要原料[5]。我們研究一種新型紫蘇腐乳產(chǎn)品，以紫蘇粕和大豆為主料進(jìn)行腐乳制坯和前發(fā)酵，通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化紫蘇腐乳毛坯前發(fā)酵工藝條件，確定最優(yōu)前發(fā)酵工藝參數(shù)，利用廢棄的紫蘇粕生產(chǎn)紫蘇腐乳新產(chǎn)品。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1　試驗(yàn)試劑與材料

1.1.1試驗(yàn)菌種

雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)：吉林工商學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2試驗(yàn)原料與試劑

紫蘇粕：紫蘇籽提取紫蘇油剩余的餅粕，產(chǎn)于吉林省白城市；大豆：產(chǎn)于吉林省農(nóng)安縣；枸杞：青海諾木洪產(chǎn)干制枸杞，經(jīng)粉碎過(guò)50目篩制成枸杞粉；食鹽：中國(guó)鹽業(yè)公司生產(chǎn)；L-酪氨酸：上海荔達(dá)生物科技有限公司；Folin-酚試劑：北京華越洋生物科技有限公司；干酪素：上海士鋒生物科技有限公司；其他試劑(分析純)：南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.1.3試驗(yàn)培養(yǎng)基

1.1.3.1菌種培養(yǎng)基

飴糖100 g，枸杞粉2 g，紫蘇豆?jié){100 mL(大豆∶紫蘇粕∶水為6∶3∶100，磨成漿液，過(guò)50目篩)，瓊脂 20 g，水 1000 mL。pH自然, 每試管分裝10 mL，121 ℃滅菌20 min擺斜面。

1.1.3.2麩皮培養(yǎng)基

麩皮100 g，枸杞粉2 g，紫蘇豆?jié){100 mL(大豆∶紫蘇粕∶水為6∶3∶100，磨成漿液，過(guò)50目篩)，分裝到三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2　試驗(yàn)儀器與設(shè)備

GR80TR型ZEALWAY自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋致微(廈門(mén))儀器有限公司；GXZ-300光照培養(yǎng)箱寧波樂(lè)電儀器制造有限公司；DHG-9053C全自動(dòng)電腦干燥箱杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海儀電分析儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái)蘇州同平凈化設(shè)備有限公司；SHZ-A型水浴恒溫振蕩器常州華奧儀器制造有限公司；2-16R高速冷凍離心機(jī)湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1風(fēng)味紫蘇腐乳的生產(chǎn)工藝流程

1.3.2菌種馴化培養(yǎng)

斜面菌種：取0.1 mL雅致放射毛霉1×106cfu/mL孢子懸液，轉(zhuǎn)接到菌種培養(yǎng)基斜面，在溫度(28±1) ℃培養(yǎng)120 h。

三角瓶菌種：取1個(gè)雅致放射毛霉斜面菌種，均勻接入5個(gè)麩皮培養(yǎng)基三角瓶，在溫度(28±1) ℃培養(yǎng)120 h[6]。

1.3.3制作紫蘇豆坯

稱(chēng)取大豆70 kg和紫蘇粕30 kg，按照料水比例1∶2加入20 ℃的溫水浸泡10 h；以大豆和紫蘇粕干料與水的質(zhì)量比1∶10加水磨制紫蘇豆?jié){，50目過(guò)濾，留取漿液加熱煮沸5 min，待漿液溫度冷卻到80 ℃加入熟石膏液(熟石膏CaSO4·1/2H2O的添加量3 kg，加入40 ℃溫水18 L)點(diǎn)漿，蹲腦15 min，壓榨切塊獲得含水量70%、規(guī)格為4 cm×4 cm×1.6 cm的紫蘇豆坯。

1.3.4前發(fā)酵試驗(yàn)

通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、種子液濃度、紫蘇豆坯的翻坯間隔時(shí)間等前發(fā)酵工藝條件，在適宜的前發(fā)酵條件下，紫蘇豆坯上長(zhǎng)滿(mǎn)雅致放射毛霉菌絲，菌絲纏繞形成一層柔韌致密的皮膜，同時(shí)雅致放射毛霉在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌大量的蛋白酶，富集在腐乳坯中，即紫蘇腐乳毛坯。腐乳毛坯在后期發(fā)酵過(guò)程中，毛霉蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解成氨基酸，形成腐乳豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和特殊的香味物質(zhì)。

1.3.5紫蘇腐乳毛坯酸性蛋白酶活力測(cè)定

采用Folin-酚試劑比色法測(cè)定紫蘇腐乳毛坯的酸性蛋白酶活力。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)計(jì)6個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平3個(gè)平行試驗(yàn)，配制濃度為100 μg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入18支試管中，每支試管中加入蒸餾水定容到1 mL，分別加入5 mL 的0.4 mol/L的Na2CO3溶液和 1 mL的Folin-酚試劑，在混勻器上混勻5 min后放入40 ℃恒溫水浴中顯色20 min，用752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)680 nm處測(cè)定吸光度值，空白對(duì)照為0 μg/mL酪氨酸溶液試管[7]。

紫蘇腐乳毛坯粗酶液的配制：取1塊紫蘇腐乳毛坯在研缽中磨碎，稱(chēng)取5.00 g磨碎的紫蘇腐乳毛坯移入另一個(gè)研缽中，加入0.3 mol/L 的氯化鈉溶液50 mL研磨。設(shè)置恒溫振蕩器溫度40 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min浸提90 min，100目紗布過(guò)濾，濾液在轉(zhuǎn)速4000 r/min、溫度4 ℃下離心15 min，保留上清液即紫蘇腐乳毛坯粗酶液[8,9]。

紫蘇腐乳毛坯的蛋白酶活力測(cè)定：準(zhǔn)備試管，其中1,2,3號(hào)管為樣品，4號(hào)管為空白對(duì)照，每支試管中加入紫蘇腐乳毛坯粗酶液1 mL，取0.4 mol/L的TCA溶液2 mL立即加入4號(hào)管，使粗酶液失去活性，1,2,3號(hào)樣品試管中加入pH 5.5的2%酪蛋白乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL搖勻，置于40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min，迅速加入2 mL的0.4 mol/L的TCA溶液終止酶解反應(yīng)，再向4號(hào)管中加入pH 5.5濃度2%的酪蛋白乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL，延續(xù)保溫20 min后取出，在4 ℃、轉(zhuǎn)速8000 r/min下離心15 min。精確移取上清液1 mL，加入5 mL的0.4 mol/L的Na2CO3溶液和1 mL的Folin-酚試劑，在混勻器上混勻5 min后放入40 ℃恒溫水浴中顯色20 min，用752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)680 nm處測(cè)定吸光度值，對(duì)照4號(hào)空白管，樣品取3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值[10]。

酶活力定義：在pH 5.5、溫度40 ℃條件下，1 g紫蘇腐乳毛坯每1 min分解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位(U)。

酶活力計(jì)算公式[11]：蛋白酶活力=A×K×N×4÷10。

式中：A為平均吸光度值(3個(gè)平行樣品);K為比色常數(shù);N為粗酶液稀釋倍數(shù);4為參與反應(yīng)試劑的體積總和(mL);10為酶解反應(yīng)的時(shí)間(10 min)。

2　試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1　種子液濃度對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

稱(chēng)取三角瓶菌種30，40，50，60，70，80，90 g，分別加入1000 mL無(wú)菌生理鹽水，分3次添加配制種子液。第1次加水用攪拌機(jī)將固體結(jié)塊均勻打碎，速度60 r/min，攪拌時(shí)間15 min，50目紗布過(guò)濾，濾渣再加無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，3次濾液混合，分別配制成濃度為3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%的種子液，(28±1) ℃保溫培養(yǎng)6 h。將紫蘇豆坯在不同濃度的種子液中浸潤(rùn)2 s接種，然后側(cè)立放置竹架中，行間距1 cm左右，有利于通風(fēng)、調(diào)節(jié)溫度及毛霉菌生長(zhǎng)。在培養(yǎng)溫度(28±1) ℃、培養(yǎng)時(shí)間72 h條件下進(jìn)行毛坯前發(fā)酵[12,13]，每間隔12 h翻坯1次，前發(fā)酵完成后測(cè)定紫蘇腐乳毛坯酸性蛋白酶活力，探究種子液濃度對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　種子液濃度對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The effect of seed liquid concentration on the enzyme activity of acid proteinase in fermented perilla soybean dreg cube

由圖1可知，種子液濃度在3%～6%之間，當(dāng)種子液濃度逐漸增加，紫蘇腐乳毛坯的酸性蛋白酶活力明顯提高，分析其原因，由于加大接菌量,縮短了菌種的生長(zhǎng)適應(yīng)期，有利于菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶；種子液濃度6%～9%，隨著種子液濃度的增加，毛坯酸性蛋白酶活力變化不顯著；種子液濃度7%時(shí)毛坯酸性蛋白酶活力達(dá)到峰值383.7 U/g；因此，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素，毛坯酸性蛋白酶活力較高的種子液濃度為6%，7%，8%[14]。

2.2　前發(fā)酵溫度對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

在2.1優(yōu)化的種子液濃度為7%條件下，分別設(shè)定前發(fā)酵溫度為22，24，26，28，30，32，34 ℃，其他同2.1。探究前發(fā)酵溫度對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　前發(fā)酵溫度對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The effect of pre-fermentation temperature on the enzyme activity of acid proteinase in fermented perilla soybean dreg cube

由圖2可知，前發(fā)酵溫度在22～26 ℃區(qū)間，逐步提高前發(fā)酵溫度，紫蘇腐乳毛坯的酸性蛋白酶活力呈明顯上升趨勢(shì)；究其原因是由于溫度的升高逐漸接近菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的適宜溫度；前發(fā)酵溫度在26～34 ℃區(qū)間，繼續(xù)提高前發(fā)酵溫度，紫蘇腐乳毛坯酸性蛋白酶活力迅速降低。究其原因是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶受到抑制；前發(fā)酵溫度為26 ℃，毛坯酸性蛋白酶活力為391.6 U/g；毛坯酸性蛋白酶活力較高的前發(fā)酵溫度為24，26，28 ℃。

2.3　前發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

采用2.2優(yōu)化的前發(fā)酵溫度26 ℃，分別選擇前發(fā)酵時(shí)間為48，54，60，66，72，78，84 h，其他同2.2。探究前發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　前發(fā)酵時(shí)間對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The effect of pre-fermentation time on the enzyme activity of acid proteinase in fermented perilla soybean dreg cube

由圖3可知，前發(fā)酵時(shí)間在48～66 h范圍內(nèi)，隨著前發(fā)酵時(shí)間的增加，毛坯酸性蛋白酶活力明顯提高，實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)由于腐乳坯中添加了紫蘇粕成分，導(dǎo)致雅致放射毛霉生長(zhǎng)適應(yīng)期延長(zhǎng)，前期生長(zhǎng)緩慢；前發(fā)酵時(shí)間在66～84 h范圍內(nèi)，隨著前發(fā)酵時(shí)間的增加，毛坯酸性蛋白酶活力逐漸降低，由于發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，環(huán)境條件的改變及雜菌污染有可能導(dǎo)致酶活力下降；前發(fā)酵時(shí)間為66 h 時(shí)毛坯酸性蛋白酶活力最高為405.6 U/g；因此，選擇毛坯酸性蛋白酶活力較高的前發(fā)酵時(shí)間為60，66，72 h。

2.4　翻坯間隔時(shí)間對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果

在2.3優(yōu)化的前發(fā)酵時(shí)間為66 h條件下，分別選擇翻坯間隔時(shí)間為8，12，16，20，24，28，36 h[15,16]，其他條件同2.3。優(yōu)化紫蘇豆坯在前發(fā)酵過(guò)程中翻坯間隔時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　翻坯間隔時(shí)間對(duì)毛坯酸性蛋白酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The effect of flip interval time on the enzyme activity of acid proteinase in fermented perilla soybean dreg cube

由圖4可知，翻坯間隔時(shí)間在8～16 h之間，逐漸延長(zhǎng)翻坯間隔時(shí)間，紫蘇腐乳毛坯的酸性蛋白酶活力緩慢升高，分析原因是由于翻坯間隔時(shí)間過(guò)短，多次翻坯增加曲室和毛坯污染幾率和毛坯的破損率，不利于毛坯前發(fā)酵的順利進(jìn)行；翻坯間隔時(shí)間在16～36 h之間，逐漸延長(zhǎng)翻坯間隔時(shí)間，毛坯酸性蛋白酶活力呈顯著下降趨勢(shì)，可能是由于毛坯與竹架接觸面長(zhǎng)時(shí)間不能正常接觸空氣，影響毛霉的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶；翻坯間隔時(shí)間為16 h時(shí)，毛坯酸性蛋白酶活力最高為409.1 U/g。因此，選擇毛坯酸性蛋白酶活力較高的翻坯間隔時(shí)間為12,16,20 h。

2.5　紫蘇腐乳毛坯的前發(fā)酵條件L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表1　紫蘇腐乳毛坯的前發(fā)酵條件L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of L9(34)orthogonal experiment of pre-fermentation conditions of fermented perilla soybean dreg cube

由表1可知，各因素對(duì)紫蘇腐乳毛坯酸性蛋白酶活力影響的順序依次為B>C>D>A，最佳方案為A1B2C2D2，種子液濃度6%、發(fā)酵溫度26 ℃、發(fā)酵時(shí)間66 h、紫蘇豆坯的翻坯間隔時(shí)間16 h；在最優(yōu)發(fā)酵條件下，紫蘇腐乳毛坯的酸性蛋白酶活力達(dá)到416.8 U/g，比優(yōu)化前提高了11.78%。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)紫蘇腐乳毛坯的前發(fā)酵工藝條件種子液濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、紫蘇豆坯的翻坯間隔時(shí)間的單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化出紫蘇腐乳毛坯的最優(yōu)前發(fā)酵工藝條件為：種子液濃度6%、發(fā)酵溫度26 ℃、發(fā)酵時(shí)間66 h、紫蘇豆坯的翻坯間隔時(shí)間16 h；在最優(yōu)發(fā)酵條件下，紫蘇腐乳毛坯的酸性蛋白酶活力達(dá)到416.8 U/g，比優(yōu)化前提高了11.78%。本研究為紫蘇腐乳新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了前發(fā)酵工藝參數(shù)。

紫蘇腐乳產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的保健價(jià)值，本研究合理利用紫蘇粕資源開(kāi)發(fā)出一種紫蘇腐乳新產(chǎn)品。

本研究以雅致放射毛霉產(chǎn)酸性蛋白酶活力為指標(biāo)，進(jìn)行了紫蘇腐乳毛坯前發(fā)酵條件的優(yōu)化；菌體產(chǎn)生中性蛋白酶和堿性蛋白酶的條件還有待進(jìn)一步研究。

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