頂空固相微萃取法對(duì)兩種大豆發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分的比較

謝蘭心，樊曉博

(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南　714000)

豆豉，我國(guó)古代稱(chēng)之為“幽菽”，是一種以黃豆或黑豆為原材料，經(jīng)細(xì)菌或霉菌發(fā)酵而成的調(diào)味品,有著悠久的歷史[1]。在我國(guó)不同的地區(qū)，豆豉的制作方法各有特色。依據(jù)發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌群的不同，豆豉被分為霉菌型和細(xì)菌型；按加工原材料的不同，可分為黑豆豆豉和黃豆豆豉；根據(jù)加工過(guò)程是否添加食鹽，可分為淡豆豉和咸豆豉。作為傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，豆豉富含蛋白質(zhì)和各種氨基酸，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美[2]，且含有人體所需的多種維生素和礦物質(zhì),具有一定的保健作用[3]，廣受我國(guó)人民群眾的喜愛(ài)。

不僅在我國(guó)，亞洲其他地區(qū)也有發(fā)酵豆制品的身影，如日本的納豆和東南亞的天培。然而，這兩者的發(fā)展現(xiàn)狀和世界范圍內(nèi)的影響力已遠(yuǎn)超豆豉。納豆不僅在日本廣受歡迎，而且已輻射到周邊國(guó)家。國(guó)外科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，納豆不僅能夠抗癌，而且能起到一定的溶解血栓功能[5]；研究結(jié)果一經(jīng)發(fā)布，納豆的發(fā)展勢(shì)頭更是令人矚目[4]。東南亞的天培則隨著印尼移民的足跡傳到了美洲、歐洲和非洲，科學(xué)家對(duì)其進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)天培具有良好的防癌、抗氧化功效，這使得天培躋身于世界高檔食品市場(chǎng)，身價(jià)倍增。反觀我國(guó)豆豉，雖然歷史悠久，營(yíng)養(yǎng)豐富，但目前對(duì)它的研究?jī)H有異黃酮和抗氧化功能2個(gè)方面，其他方面仍有待進(jìn)一步研究。目前我國(guó)許多豆豉生產(chǎn)廠家仍采用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)品檔次均無(wú)法滿足消費(fèi)者的需求，發(fā)展前景堪憂。

至于風(fēng)味，目前在我國(guó)，已有人對(duì)細(xì)菌型豆豉的香味成分進(jìn)行了分析[6]，但是，作為中國(guó)豆豉主流產(chǎn)品的霉菌型豆豉,其香味成分研究卻少見(jiàn)報(bào)道[7,8]。

為了研究原料豆經(jīng)發(fā)酵后的理化性質(zhì)改變，首先對(duì)原料豆(黑豆和黃豆)的各理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和對(duì)比，主要包括水分、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分等。以曲霉為主要菌種制作豆豉，只加入少量食鹽以保持豆豉的原味。至于風(fēng)味物質(zhì)的提取，采用了頂空固相微萃取法。并通過(guò)GC-MS聯(lián)用和氣相吸聞技術(shù)對(duì)2種豆豉的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了鑒定和比較。最后，對(duì)成品豆豉的理化性質(zhì)進(jìn)行了比較。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器

Agilent 6890N/5975MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋、DZF-6021真空干燥箱、DHG-9123電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、分析天平、電子天平、DHG-9123電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SP-752型UV-Vis分光光度計(jì)、電子萬(wàn)用爐、DH3600B電熱恒溫培養(yǎng)箱、SHA-B恒溫振蕩器、手提式蒸汽滅菌鍋、通風(fēng)櫥、打粉機(jī)、索氏提取器、微量凱氏定氮裝置。

1.1.2試劑

黑豆(black bean)、黃豆(soybean)、乙醚、濃硫酸、氫氧化鈉、二氯甲烷、正戊烷、鹽酸、硼酸、甲基紅、茚三酮、3,5-二硝基水楊酸，以上試劑均為分析純。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1理化指標(biāo)的測(cè)定

1.2.1.1水分含量的測(cè)定

將黑豆、黃豆、黑豆豉和黃豆豉在粉碎機(jī)中打成粉末狀，取清潔干燥的干燥瓶，在分析天平上稱(chēng)取干燥瓶重量并記錄，準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g左右粉末于干燥瓶?jī)?nèi)，記錄樣品和瓶的重量，將樣品置于真空干燥箱內(nèi)烘干12 h，烘干完成后精確稱(chēng)干燥后樣品和瓶的重量并計(jì)算。

1.2.1.2凱氏定氮法測(cè)粗蛋白含量

稱(chēng)取0.3 g左右樣品粉末于消化瓶中，采用凱氏定氮法測(cè)定樣品中粗蛋白含量并記錄。

1.2.1.3脂肪含量的測(cè)定

用分析天平稱(chēng)取2 g左右干燥樣品，索氏抽提法測(cè)定樣品脂肪含量并記錄。

1.2.1.4粗灰分的測(cè)定

將瓷坩堝置于馬福爐灼燒0.5 h，冷卻后精確稱(chēng)量并記錄；稱(chēng)取粉碎干燥后的2 g左右樣品，將樣品放入坩堝中，記錄質(zhì)量。

將裝有樣品的坩堝放入馬福爐中，在500～600 ℃灼燒至無(wú)炭粒(即灰化完全)。冷卻到200 ℃以下時(shí)，移入干燥器中冷卻，待冷卻至室溫后稱(chēng)量，重復(fù)灼燒至前后2次稱(chēng)量差不超過(guò)0.5 mg為恒重。最后冷卻后精確稱(chēng)量坩堝和總灰分的質(zhì)量并計(jì)算。

1.2.1.5茚三酮法測(cè)豆豉中氨基酸的含量

配制茚三酮溶液；制作異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品處理及測(cè)定：

稱(chēng)取粉末狀樣品各5 g左右，并準(zhǔn)確記錄；加入50 mL蒸餾水，放置于電爐上加熱煮沸，再無(wú)損地過(guò)濾至100 mL容量瓶中，用熱水洗滌殘?jiān)鼣?shù)次，定容至100 mL；再吸取10 mL定容后的溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。取樣液加入現(xiàn)配的茚三酮溶液，搖勻后靜置15 min，在570 nm波長(zhǎng)下比色，并記錄計(jì)算。

1.2.1.6總酸的測(cè)定

用已知濃度的鹽酸溶液標(biāo)定氫氧化鈉溶液；測(cè)定方法：

稱(chēng)取粉末狀樣品各5 g左右，并準(zhǔn)確記錄；加入50 mL蒸餾水并煮沸，再無(wú)損過(guò)濾至100 mL容量瓶中，用熱水洗滌殘?jiān)鼣?shù)次，后定容至100 mL；再吸取10 mL定容后溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。吸取20 mL樣品，滴入2滴酚酞，用已標(biāo)定的氫氧化鈉溶液滴定至初顯粉色，即為終點(diǎn)。記錄消耗的氫氧化鈉溶液體積，據(jù)此計(jì)算樣品中總酸的含量。

1.2.1.73,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖(DNS法)

制作葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品處理及測(cè)定：

稱(chēng)取豆豉樣品3 g左右，并準(zhǔn)確記錄，加入50 mL蒸餾水于50 ℃水浴20 min，多次過(guò)濾洗滌，并定容至100 mL，取樣液加入3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)并搖勻，沸水浴5 min，取出后立即放入涼水中冷卻至室溫，定容至25 mL，在540 nm波長(zhǎng)下比色并記錄。

1.2.1.8碳水化合物的測(cè)定

采用差值法，按下式計(jì)算：

碳水化合物(%)=100%-(水分+蛋白質(zhì)+脂肪+灰分)%。

1.2.2豆豉揮發(fā)性成分鑒定

1.2.2.1頂空固相微萃取法(SPME)提取豆豉中風(fēng)味物質(zhì)

在頂空瓶底部加入1粒轉(zhuǎn)子，稱(chēng)取5 g粉碎樣品置于20 mL鉗口瓶中，加入20 mL蒸餾水，用聚四氟乙烯隔墊密封,于磁力攪拌器上在60 ℃加熱平衡15 min后,通過(guò)隔墊插入已活化好的SPME萃取頭(270 ℃活化30 min),推出纖維頭,頂空吸附40 min后,插入GC進(jìn)樣口解吸5 min。

1.2.2.2色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣：氦氣；柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，不分流進(jìn)樣；起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃,再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件:接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；離子化方式EI；電子能量70 eV，質(zhì)量范圍35～350 amu。

1.2.2.3化合物鑒定及定量

樣品的揮發(fā)性化合物經(jīng)氣相色譜分離，不同組分形成其各自的色譜峰，用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定。分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST/WILEY)進(jìn)行初步檢索及資料分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　原料豆理化指標(biāo)

表1　黑豆和黃豆的理化指標(biāo)　%

由表1可知，黑豆的粗蛋白含量和粗灰分略高于黃豆，而黃豆的脂肪、水分和碳水化合物含量略高于黑豆。

2.2　SPME法分析豆豉中揮發(fā)性成分

表2　豆豉揮發(fā)性成分經(jīng)SPME提取后的GC-MS分析結(jié)果

續(xù)　表

由表2可知，2種不同的豆豉樣品經(jīng)SPME方法、GC-MS分析后共檢測(cè)出9類(lèi)、65種揮發(fā)性化合物。其中黃豆豉檢出酸類(lèi)3種、醇類(lèi)3種、酯類(lèi)12種、醛類(lèi)9種、酚類(lèi)1種、雜環(huán)類(lèi)3種、烴類(lèi)6種、其他類(lèi)1種，共38種揮發(fā)性化合物。黑豆豉檢出酸類(lèi)6種、醇類(lèi)1種、酯類(lèi)4種、醛類(lèi)6種、酮類(lèi)2種、酚類(lèi)2種、雜環(huán)類(lèi)4種、烴類(lèi)9種、其他類(lèi)2種，共36種揮發(fā)性化合物。2種豆豉中各類(lèi)揮發(fā)性化合物所占比例見(jiàn)圖1。

圖1　經(jīng)SPME法提取的2種豆豉揮發(fā)性成分的比較

由圖1可知，黃豆豉中最主要的揮發(fā)性化合物是醛類(lèi)，其次是醇類(lèi)、酯類(lèi)和烴類(lèi)。而黑豆豉中最主要的揮發(fā)性物質(zhì)也是醛類(lèi)，但是酸類(lèi)的百分含量在黑豆豉中也占了較大的比例。

經(jīng)SPME法檢測(cè)，黃豆豉所得到的揮發(fā)性成分相對(duì)百分含量較高的有苯乙醛(10.5608%)、2，3-丁二醇(6.0176%)、苯乙烯(4.9051%)、苯甲醛(4.588%)、乙酸(2.194%)、γ-壬內(nèi)酯(1.9923%)、小茴香醛(1.8813%)、3-甲硫基丙醛(1.5833%)、乙基香蘭素(1.5379%)、十四酸乙酯(1.3875%)、壬醛(1.158%)和γ-十一內(nèi)酯(1.0658%)。

經(jīng)SPME法檢測(cè)，黑豆豉所得到的揮發(fā)性成分相對(duì)百分含量較高的有3-甲基丁酸(12.1981%)、苯乙醛(6.9729%)、反-2-庚烯醛(6.5372%)、D-檸檬烯(6.1124%)、苯甲醛(4.1037%)、庚烯酮(2.7924%)、反-2-辛烯醛(2.5627%)、2-甲基己酸(2.5563%)、辛烯酮(2.2062%)、2-甲基丁酸(1.6304%)和丁酸(1.6%)。

比較2種樣品所檢測(cè)出的結(jié)果，2種樣品均有的揮發(fā)性物質(zhì)只有丙酸、苯乙醇、十四酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和檸檬烯。經(jīng)氣相吸聞法分析，其中，苯乙醇具有特有的玫瑰花的香氣；苯甲醛具有較濃重的苦杏仁氣味和焦味；苯乙醛氣味香甜，有玫瑰花香及些許發(fā)酵韻味；壬醛有類(lèi)似玫瑰花的香氣；丙醛具有類(lèi)似甜香、柑橘香、蠟香、花香的氣味，這些物質(zhì)可能對(duì)豆豉的風(fēng)味有一定影響。

經(jīng)SPME檢測(cè)，黃豆豉特有的揮發(fā)性化合物有γ-壬內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯、小茴香醛和乙基香蘭素等。其中，γ-壬內(nèi)酯具有椰子型香氣，略帶茴香香韻，稀釋后有杏、李子香氣；γ-十一內(nèi)酯又稱(chēng)桃醛，具有桃子、椰子、堅(jiān)果、奶油、香子蘭的氣味；乙基香蘭素具有類(lèi)似香莢蘭豆的香氣，這些都可能對(duì)黃豆豉的風(fēng)味做出貢獻(xiàn)。而黑豆豉中特有的揮發(fā)性成分有1-辛烯-3-酮、1-庚烯-3-酮、反-2-庚烯醛和反-2-辛烯醛等。其中1-辛烯-3-酮具有蘑菇類(lèi)氣味；反-2-庚烯醛具有油脂香和果香；反-2-辛烯醛具有新鮮的黃瓜、清香的藥草氣息。

2.3　豆豉理化指標(biāo)

經(jīng)汪立軍等[9]的研究，豆豉中的風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)源于大豆?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)微生物酶水解后生成的各種次級(jí)產(chǎn)物和小分子終產(chǎn)物。如蛋白質(zhì)水解生成多肽、氨基酸，其中谷氨酸、天門(mén)冬氨酸具有鮮味，而酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氧化后可生成黑色素；淀粉經(jīng)酶水解生成糊精和麥芽糖，最終生成葡萄糖；葡萄糖經(jīng)微生物酶水解又可生成乙醇、乙醛、乙酸、乳酸等多種小分子產(chǎn)物；而脂肪水解成甘油和脂肪酸，其中脂肪酸又是構(gòu)成酯類(lèi)的來(lái)源之一。這些次級(jí)產(chǎn)物和小分子物質(zhì)有的本身具有香氣，有的可以與其他物質(zhì)作用生成色素、酯類(lèi)等香氣成分。

對(duì)2種豆豉理化指標(biāo)進(jìn)行的比較見(jiàn)表3。

表3　2種豆豉的理化指標(biāo)

比較發(fā)現(xiàn)，黃豆豉的蛋白和氨基酸含量都高于黑豆豉，而黑豆豉的總酸和還原糖含量都高于黃豆豉。這些主要成分含量的差異可能是2種豆豉口味不同的原因之一。

3　結(jié)論

3.1　SPME法所得到的揮發(fā)性物質(zhì)總結(jié)

采用固相微萃取方法對(duì)2種大豆豆豉進(jìn)行鑒定，黃豆豉共鑒定出38種揮發(fā)性化合物，其中酸類(lèi)3種、醇類(lèi)3種、酯類(lèi)12種、醛類(lèi)9種、酚類(lèi)1種、雜環(huán)類(lèi)3種、烴類(lèi)6種、其他類(lèi)1種；黑豆豉共鑒定出37種揮發(fā)性化合物，其中酸類(lèi)6種、醇類(lèi)1種、酯類(lèi)4種、醛類(lèi)6種、酮類(lèi)2種、酚類(lèi)2種、雜環(huán)類(lèi)4種、烴類(lèi)10種、其他類(lèi)2種。2種豆豉共同檢出的豆豉主要香氣成分有：苯乙醇、十四酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和檸檬烯。

3.2　2種豆豉特征風(fēng)味物質(zhì)總結(jié)

3.2.1黃豆豉中特征風(fēng)味物質(zhì)

丁內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、γ-十一內(nèi)酯、丁酸丁酯、丁二酸二乙酯、香蘭素、乙基香蘭素、吲哚、吲哚嗪、香豆素等。

3.2.2黑豆豉中特征風(fēng)味物質(zhì)

5-辛內(nèi)酯、1-辛烯-3-酮、1-庚烯-3-酮、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛等。

可見(jiàn)2種豆豉具有不同的揮發(fā)性風(fēng)味成分，2種豆豉的理化指標(biāo)也有差異，這也是賦予2種豆豉不同感官風(fēng)味的原因。

3.3　今后實(shí)驗(yàn)方向

實(shí)驗(yàn)室中常用的風(fēng)味萃取方法有3種，一種是本文所用的SPME(頂空固相微萃取法)，此外還有同時(shí)蒸餾萃取(SDE)和固液萃取(S-L)法。在后面的實(shí)驗(yàn)中可以采用3種方法分別對(duì)黑豆豉和黃豆豉的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行測(cè)定，比較3種萃取方法的優(yōu)劣，并根據(jù)結(jié)果選取更為合適的萃取方法。同時(shí)也可采用感官評(píng)定方法對(duì)2種豆豉的感官風(fēng)味做評(píng)定。

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