山西老陳醋發酵過程中高產酸乳酸菌的鑒定

于迪 ，喬羽，范振宇，邢曉瑩，王如福*

(1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷　030801；2.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷　030801)

山西老陳醋發酵過程需要霉菌、酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等眾多微生物共同參與[1]，不同微生物在不同發酵時期的代謝及相互作用為老陳醋風味的形成奠定了物質基礎[2]。乳酸菌能夠利用葡萄糖代謝產生乳酸，乳酸含量高的食醋，能夠減緩總酸含量過高帶來的尖酸刺激口感，使其酸味更加柔和、醇厚[3]。此外，乳酸菌產生的乳酸與醇類物質發生酯化反應形成的乳酸乙酯等酯類物質，是山西老陳醋香氣的主要成分之一[4-6]。

傳統的乳酸菌鑒定方法需要做大量的生理生化試驗，且過程繁瑣，結果不穩定。近年來，利用16S rDNA序列分析等分子生物技術進行微生物的鑒定已成為最常用的檢測方法[7-9]。本試驗對山西老陳醋發酵過程中酒化階段和醋化階段分離出的乳酸菌進行產酸試驗以及酒精、乙酸、溫度耐受性試驗，篩選出產酸量高、耐受性好的優勢菌株，通過形態學特征以及16S rDNA序列分析對篩選出的優勢乳酸菌進行鑒定。擬為下一步高產酸乳酸菌在山西老陳醋發酵過程中的強化應用提供良好的菌種基礎。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑與設備

1.1.1菌株

實驗室前期從山西老陳醋發酵過程中酒化階段的酒醪中分離出的10株乳酸菌，編號JL1～JL10；醋化階段的醋醅中分離出的25株乳酸菌，編號CL11～CL35。

1.1.2試劑

氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、TAE緩沖液、rTaq DNA聚合酶(Takara公司產品)、DNA 分子量 Marker(Takara公司產品)、dNTPS(Takara 公司產品)。

MRS肉湯培養基：蛋白胨10.0 g、乙酸鈉5.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、硫酸鎂0.2 g、檸檬酸三胺2.0 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2.0 g，定容至1000 mL，121 ℃，20 min滅菌。

50×TAE Buffer 配制方法:(1)稱量Tris 242 g，Na2EDTA·2H2O 37.2 g于1 L燒杯中；(2)向燒杯中加入約800 mL去離子水，充分攪拌均勻；(3)加入57.1 mL的冰乙酸，充分溶解；(4)用NaOH調pH至8.3，加去離子水定容至1 L后，室溫保存。使用時稀釋50倍，即1×TAE Buffer。

1.1.3試驗設備

全自動高壓滅菌器MCS-3020日本三洋公司；BPX-272電熱恒溫培養箱上海博訊實業有限公司；9700型PCR擴增儀美國ARI公司；旋渦震蕩儀麒麟醫用儀器廠；2100型分光光度計上海光譜儀器有限公司；凝膠成像系統美國RICAN BIO-RAD公司；可調式微量移液器、Centrifuge 5415R低速冷凍離心機德國Eppendorf公司。

1.2　試驗方法

1.2.1產酸試驗方法

菌株的活化：取出甘油保藏的35株乳酸菌，將菌液接種到滅菌后的MAS平板上，37 ℃恒溫培養箱中培養24～36 h后，將MAS平板長出的乳酸菌再接種到MAS斜面上，37 ℃的恒溫培養箱中培養24～36 h，以此活化2次，備用。

全域旅游要求全社會參與，全民參與旅游業，加大旅游與其他產業的融合力度，達到資源共享。旅游交通、旅游公共服務、智慧旅游三個系統構成了景區全域化發展一體化機制。借助“微社區”[6]模式突出社區居民參與，社區居民主動融入文旅產業的發展，是對自身的身份認同、文化認同、情感認同。當地居民對外來游客的態度影響著當地文旅產業的發展，所以在發展旅游產業的同時兼顧社區居民的綜合利益也是至關重要的。

將活化后的菌株分別接種到滅菌后的9 mL MAS肉湯培養基中，在37 ℃的恒溫培養箱中培養48 h，取出后搖勻，移取4 mL菌液，加入36 mL蒸餾水將菌液稀釋10倍。用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH為8.2，記錄消耗的NaOH溶液的體積。用NaOH溶液的消耗量來計算乳酸菌的產酸量。同樣的方法做3次平行試驗。

產酸量計算公式(以乙酸計)為：

式中：X為菌液的產酸量(以乙酸計)，g/dL；V1為測定用乳酸菌菌液消耗NaOH標準滴定液的體積，mL；V2為空白培養基消耗NaOH標準滴定液的體積，mL；c為NaOH標準滴定液的濃度，mol/L；V為菌液的體積，mL；0.09為1.00 mL氫氧化鈉標準滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當于乳酸的質量，g。

1.2.2耐受性試驗方法

1.2.2.1酒精耐受性試驗方法

將活化的乳酸菌菌液按6%的比例接種于滅菌后的乙醇濃度分別為0，3%，6%，9%，12%的MRS肉湯培養基中，在37 ℃的恒溫培養箱中培養48 h。在分光光度計波長600 nm處測定菌液的OD值，并做空白對照試驗。

1.2.2.2乙酸耐受性試驗方法

將活化好的乳酸菌菌液按6%的比例接種于滅菌后的乙酸濃度分別為0，1，2，3，5 g/dL的MRS肉湯培養基中，在37 ℃的培養箱中培養48 h。在分光光度計波長600 nm處測定菌液的OD值，并做空白對照試驗。

1.2.2.3溫度耐受性試驗方法

將活化好的乳酸菌菌液按6%的比例接種于滅菌后的MRS肉湯培養基中，分別在30，35，40，45，50 ℃的培養箱中培養48 h。在分光光度計波長600 nm處測定菌液的OD值，并做空白對照試驗[10,11]。

1.2.3形態特征觀察[12]

菌落形態觀察：觀察菌落的大小、形狀、邊緣狀況等特征，并記錄結果。

1.2.416S rDNA鑒定

1.2.4.1按試劑盒的說明進行菌株DNA提取

1.2.4.2PCR擴增

PCR擴增見表1。

表1　PCR擴增Table 1 PCR amplification

PCR反應條件：對擴增產物進行電泳檢測，PCR擴增后，在2%瓊脂糖凝膠中加入2 μL擴增產物和5 μL染液充分混合后進行電泳，電泳時電壓為5 V/cm，時間為45 min，電泳液為1×TAE。通過UVP凝膠成像系統觀察電泳的條帶圖，見圖1。

圖1　電泳條帶圖Fig.1 Electrophoresis bar graph

1.2.4.3測序及分析

將PCR擴增后的菌株DNA送至上海生物工程股份有限公司進行16S rDNA鑒定。測序結果提交到Genbank基因庫中，通過Blast比對進行同源性分析，建立系統發育樹，分析其親緣關系，對待測菌株進行鑒定。

2　結果與分析

2.1　高產酸乳酸菌的篩選

經過產酸量試驗后，得到35株乳酸菌的產酸量，見圖2。

圖2　35株乳酸菌的產酸量Fig.2 Acid yield of 35 strains of suspected lactic acid bacteria

經過對35株乳酸菌產酸量的測定后，從中篩選出產酸量在7.50 g/dL以上的菌株8株，編號分別是JL6，JL9，CL20，CL21，CL28，CL29，CL31，CL33。其中產酸量最高的是醋化階段的CL21菌株，產酸量達到10.02 g/dL，其次是酒化階段的JL6菌株，產酸量為9.73 g/dL。

2.2　高產酸乳酸菌的耐受性試驗

2.2.1酒精耐受性試驗

經過酒精耐受性試驗后，產酸量較高的8株乳酸菌在不同酒精濃度的培養基中培養48 h后的菌液OD值見圖3。

圖3　8株菌株在不同酒精濃度下的OD值Fig.3 OD values of 8 strains of suspected lactic acid bacteria with different alcohol concentration

在山西老陳醋發酵過程中的酒化階段，原料中的還原糖在酒化酶的作用下轉化成乙醇，使酒醪的酒精度逐漸升高[13]，能夠達到7°～8°，甚至高至10°，所以篩選的菌株要對酒精有較好的耐受性。由圖3可知，在不同酒精濃度條件下，與其他菌株相比，JL6，CL21，CL33菌株的OD值較高，所以它們的酒精耐受性較好。其中JL6菌株在不同酒精濃度下的OD值都是最高的，其次是菌株CL21。可能由于菌株JL6從酒化階段的酒醪中分離出，長期的馴化使其對酒精有較好的耐受性。

2.2.2乙酸耐受性試驗

經過乙酸耐受性試驗后，產酸量較高的8株乳酸菌在不同乙酸濃度的培養基中培養48 h后的菌液OD值見圖4。

圖4　8株菌株在不同乙酸濃度下的OD值Fig.4 OD values of 8 strains of suspected lactic acid bacteria with different acetic acid concentration

醋化階段，醋醅中底物豐富，環境也適合醋酸菌等微生物的生長，醋酸菌代謝產生的醋酸逐漸增多，導致醋醅的酸度快速增長，最高時能達到5 g/dL，因此隨著發酵的進行，只有耐酸性好的菌株，才能在醋醅中存活。由圖4可知，在不同乙酸濃度條件下，JL6，CL21，CL33菌株的OD值相對較高，其中CL21菌株的OD值在不同乙酸濃度下最高，其次是菌株JL6，最后是菌株CL33。

2.2.3溫度耐受性試驗

經過溫度耐受性試驗后，產酸量相對較高的8株菌株在不同溫度條件下的OD值結果見圖5。

圖5　8株乳酸菌在不同溫度下的OD值Fig.5 OD values of 8 strains of suspected lactic acid bacteria at different temperatures

醋化階段，隨著火醅的接入，微生物活動旺盛，醋醅的溫度逐漸升高，醋酸發酵第5天，醋醅中的溫度能夠達到48 ℃[14]，因此，篩選出的優勢乳酸菌，不僅能夠耐受較高的酒精度和酸度，同時對溫度也要有足夠的耐受性。由圖5可知，在不同溫度條件下，菌株JL6，CL21，CL33的OD值較高，其中菌株CL21的OD值最高，在45 ℃時OD值是1.725，50 ℃時OD值是0.361，其次是菌株JL6，最后是菌株CL31。

2.3　菌株的形態觀察

觀察篩選出的2株優勢乳酸菌在MRS固體培養基上形成的菌落情況，單菌落形態圖見圖6。經革蘭氏染色后在油鏡下觀察到的細胞形態見圖7。對其形狀、大小、顏色、表面狀態以及細胞形態等方面進行描述，見表2。

圖6　2株乳酸菌在MRS瓊脂培養基上形成的菌落Fig.6 Colony of 2 strains of lactic acid bacteria on MRS agar medium

圖7　乳酸菌菌株經革蘭氏染色在油鏡下觀察到的細胞形態Fig.7 The morphology of lactic acid bacteria strains observed under oil microscope by Gram staining

表2　山西老陳醋發酵過程中2株乳酸菌菌落形態Table 2 Colony morphology of 2 strains of LAB isolated from fermentation of Shanxi mature vinegar

2.4　菌株16S rDNA鑒定

2.4.1PCR 擴增

將篩選出產酸量高、耐受性較好的2株待測乳酸菌進行DNA的提取鑒定，利用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測待測序菌株的16S rDNA PCR擴增產物。2株待測菌株的16S rDNA PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖8。

圖8　DNA樣本進行的PCR擴增產物電泳結果Fig.8 Electrophoresis results of PCR products

由圖8可知，1500 bp附近出現亮條帶，說明2株菌的 PCR產物擴增成功。

2.4.2系列對比

將所測序列結果提交NCBI網站，經BLAST檢索系統對序列同源性的比較分析可知2株菌分別與發酵乳桿菌和干酪乳桿菌相似。為顯示各菌株與相似菌種之間的親緣關系及其系統地位，由圖9可知，用MEGA生物學軟件中的分析法Neighbour-joining構建系統發育樹[15]，見圖9。

圖9　菌株 16S rDNA 基因序列的系統進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of strain 16S rDNA gene sequences

3　討論

趙國忠等[16]對食醋發酵過程中的酒醪分離出的乳酸菌進行鑒定，發現植物乳桿菌占有數量較多，是酒化階段的主要細菌，在食醋發酵過程中發揮著重要作用；Wu等[17]利用分子生物學技術研究山西老陳醋發酵過程中細菌真菌的生物多樣性，發現酒化階段的主要乳酸菌包括植物乳桿菌、發酵乳桿菌、乳酸片球菌、布氏乳桿菌等；Nie Zhiqiang等[18]在分析山西老陳醋發酵過程中微生物群落的動態演替和多樣性時，發現酒化階段的乳酸菌主要為魏斯氏乳桿菌和植物乳桿菌，醋化階段的乳酸菌為瑞士乳桿菌、耐酸乳桿菌等。本試驗中酒化階段篩選出的菌株JL6為發酵乳桿菌，醋化階段篩選出的菌株CL21為干酪乳桿菌，與本領域中其他研究相比有一定的區別，這可能與釀醋所用原料和大曲有關，不同地域所處環境中的微生物種類不同，大曲制作過程中所接觸的微生物也各不相同，因此不同廠家的酒醪醋醅中分離出的微生物種類也有所差異。

4　結論

本文通過產酸定量試驗、耐受性試驗，對山西老陳醋發酵過程中分離出的35株乳酸菌進行篩選，最終篩選出產酸量高、耐受性好的菌株JL6，CL21，產酸量分別為9.73 g/dL和10.02 g/dL，經16S rDNA鑒定分別為發酵乳桿菌和干酪乳桿菌。本研究可以為下一步研究乳酸菌的生長性能和發酵特性、菌種的選育、菌劑的生產以及在山西老陳醋發酵過程中的強化應用等方面提供良好的菌種基礎，對推動我國食醋行業的發展具有重要意義。

參考文獻：

[1]呂艷歌,馬海亮,李云亮,等.山西老陳醋產酸菌的分離鑒定及系統學分析[J].中國食品學報,2013(12):163-171.

[2]杜宏福,聶志強,劉賢,等.山西老陳醋發酵過程中細菌群落組成與有機酸變化的關系研究[J].中國調味品,2015,40(7):26-31,42.

[3]張國華,何國慶.傳統發酵食品中的乳酸菌多樣性及其功能特性[J].中國食品學報,2013(9):174-181.

[4]閆彬,賀銀鳳.乳酸菌與酵母菌共生機理綜述[J].食品科學,2012(3):277-281.

[5]王夢穎,趙國忠,趙建新,等.山西老陳醋發酵過程菌群微生態分析及乳酸菌分離[J].中國調味品,2016,41(6):29-33，38.

[6]蔣忠,馮文利,王偉,等.乳酸菌和酵母菌共酵改善食醋品質的研究[J].中國釀造,2015,34(9):104-108.

[7]付曉艷.利用16S rRNA基因部分序列的聚類分析鑒定乳酸球菌[D].哈爾濱：東北農業大學,2005.

[8]龔加路，趙興秀，鄒偉，等.高產酸乳酸菌的分離鑒定及其益生特性的研究[J].中國調味品，2016，41(3)：17-20，31.

[9]Zheng X W,Yan Z,Nout M J R,et al.Microbiota dynamics related to environmental conditions during the fermentative production of Fen-Daqu, a Chinese industrial fermentation starter[J].International Journal of Food Microbiology, 2014,182(28):57-62.

[10]郭明燁,劉軍,王洋,等.四川麩醋醋醅中一株乳酸菌的篩選及鑒定[J].中國調味品，2016,41(5)：23-29.

[11]張志燕,錢靜亞,馬真,等.鎮江香醋醋醅中優勢高產酸醋酸菌菌株的篩選[J].食品工業科技,2016(11):174-178，194.

[12]凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社,1999.

[13]張奶英.四川麩醋發酵過程中理化指標與微生物菌相的動態分析[J].食品工業科技,2014(11):174-178.

[14]孫峰宇.乳酸菌的分離鑒定及在食醋釀造中的應用[D].天津：天津科技大學,2013.

[15]蔡妙英,東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001.

[16]趙國忠,孫峰宇,姚云平,等.老陳醋釀造過程中乳酸菌篩選及對風味的影響[J].食品工業科技，2014,35(24):159-163.

[17]Wu J J,Ma Y K,Zhang F F,et al.Biodiversity of yeasts, lactic acid bacteria and acetic acid bacteria in the fermentation of "Shanxi aged vinegar", a traditional Chinese vinegar[J].Food Microbiology,2012,30(1):289-297.

[18]Nie Z,Zheng Y,Du H,et al.Dynamics and diversity of microbial community succession in traditional fermentation of Shanxi aged vinegar[J].Food Microbiology,2015(47):62-68.