一種食品中豬源性成分的快速檢測技術(shù)

李 鑫，孫甸甸，張慧娟，馮娜娜，尹秋源，尹 銳

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林132101）

1 前言

近年來，食品安全問題日益突出，其中肉及其制品的摻假現(xiàn)象十分嚴(yán)重，成為行業(yè)、消費(fèi)者和研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。2013年西安通報了一起“9.10”特大制販假牛肉案，共查處17t假牛肉，這些假牛肉其實(shí)均為豬肉[1]。雖然食用豬肉不會對食品安全產(chǎn)生直接的影響，但是這揭示了食品供應(yīng)鏈可追溯性存在的問題。豬肉由于價格相對便宜，一些商家為獲取暴利，將豬肉摻入牛、羊肉出售。這種行為嚴(yán)重擾亂了市場秩序；危害了消費(fèi)者的健康和經(jīng)濟(jì)利益；同時也造成一些宗教信仰方面的擔(dān)憂和恐慌[2]。因此，通過物種鑒別實(shí)驗(yàn)對豬源性成分進(jìn)行檢測尤為重要[3-5]。

基于蛋白質(zhì)的檢測和DNA的檢測是動物源性成分鑒別的主要方法。基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)包括電泳分析法[6]、色譜分析法[7]和免疫分析法[8]等；肉制品中蛋白質(zhì)會受到多種因素的影響，即使同一物種間也會存在一定的差異，且加工食品中蛋白質(zhì)易發(fā)生變性而無法檢出。相對于蛋白質(zhì)，DNA具有較高的熱穩(wěn)定性和種屬特異性[9-10]。近年來，基于 DNA的方法，包括DNA雜交[11]、PCR-RFLP[12]和物種特異性PCR[13]等被用于動物源性成分的檢測研究。物種特異性PCR由于檢測快速，特異性強(qiáng)、靈敏性高的優(yōu)勢，已經(jīng)成為動物源性成分鑒定的主流方法[14]。

本研究根據(jù)豬線粒體cytb基因設(shè)計特異引物用于豬源性成分的檢測。為相關(guān)執(zhí)法部門打擊不法商販、維護(hù)消費(fèi)者合法利益提供有力科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

豬、羊、牛、雞、鵝、鴨肉均購置長春市某地方市場，購買后經(jīng)形態(tài)鑒定。 豬肉火腿（n=4）、熟豬肉(n=7)、牛肉脯(n=6)、肉牛罐頭(n=9)、牛肉卷(n=7)購自某超市，同一種類的肉制品均來自不同的生產(chǎn)廠家。

PCR Master Mix試劑盒 (美國ABI公司);蛋白酶K;CTAB、EDTA、Tris-HCl、NaCl、氯仿、異戊醇、Tris 飽和酚、異丙醇、70%乙醇（均購自上海生物工程有限公司)。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取 將豬肉樣品和其他肉制品剪碎，分別準(zhǔn)確稱取各肉樣0.1g，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入800μL 裂解液 (每 100mL 含 CTAB 1 g、EDTA 0.3722g、Tris-HCl 0.7882g、NaCl 4.09g,調(diào)至 pH8.0,高溫高壓滅菌)，65℃孵育 30 min，期間振蕩混勻3～4次，12000×g離心5min；上清液移入一潔凈離心管中，加入 400μL三氯甲烷-異戊醇(24∶1)，振蕩混勻后12000×g離心5min；取上清液于另一潔凈離心管中，加入320μL異丙醇，室溫沉淀30 min；12000×g離心5min，棄上清液，向沉淀中加入500μL 70%乙醇漂洗，12000×g離心5min，棄上清液，沉淀晾干，用20μL TE緩沖液溶解沉淀，經(jīng)OD值測定后于-20℃保存。

2.2.2 特異性引物的設(shè)計 在GenBank中檢索豬線粒體cytb基因序列(accession KY432578.1)。用 DNAStar軟件設(shè)計特異性引物。對確定的基因特異引物經(jīng)GeneBank (http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中Blast程序進(jìn)行相似序列搜索后，確定其與常見動物源性成分無交叉反應(yīng)，用于實(shí)驗(yàn)。本研究的特異性引物序列如下，上游引物：5’-ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC-3’ (31 bp,Tm 63.3℃),下游引物∶5’-CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG-3’ (25 bp,Tm 64.6℃)；引物由上海生物工程有限公司合成。

2.2.3 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)體系∶其中PCR Master Mix 5.2μL,10μmol/L 引物各 0.8μL,模板 DNA 1μL,ddH2O 17.2μL，總體積 25μL。 反應(yīng)條件如下∶95℃預(yù)變性 5min,95℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40個循環(huán)。

2.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳檢測 將5μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上于110V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.5 靈敏度及特異性 為驗(yàn)證該方法的靈敏性，用雙蒸餾水對純化的豬肉DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，使每個PCR反應(yīng)中的豬肉 DNA 含量分別為 10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg。PCR擴(kuò)增后取上述PCR產(chǎn)物5μL經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。為驗(yàn)證該方法的特異性，分別提取豬、羊、牛、雞、鵝、鴨肉基因組DNA，分別以1ng上述基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測以驗(yàn)證該方法的特異性。

2.2.6 實(shí)際樣品的檢測 從超市購買銷售比例較大并標(biāo)明成分的33份豬肉及牛肉制品,如2.1分別按上述方法提取其基因組DNA，通過豬源性PCR-電泳檢測以評價其在實(shí)際樣本檢測中的適用性。

3 結(jié)果與討論

3.1 特異性實(shí)驗(yàn)

本研究根據(jù)豬線粒體cytb基因設(shè)計引物，分別對豬及其他5種動物源性成分（羊、牛、雞、鵝、鴨）的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果通過電泳檢測。僅豬DNA檢測結(jié)果呈陽性，其他對照以及空白對照均為陰性（如圖1）。因此，該方法具有較高的特異性。

3.2 靈敏性實(shí)驗(yàn)

將純化的豬肉DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其靈敏度達(dá)到100pg（如圖2）。

3.3 商業(yè)樣品的檢測

從超市購買銷售比例較大并標(biāo)明主要成分的33份豬肉及牛肉制品，用上述方法提取待測樣品DNA，通過豬源性成分PCR-電泳檢測，每個樣品做了一個平行樣。所有的豬肉制品檢測結(jié)果均為陽性；在部分牛肉罐頭、牛肉脯等干制品中檢測出豬源性成分，結(jié)果見表1。對檢測結(jié)果與商品標(biāo)識不一致的樣品，對其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果與預(yù)期的豬源性基因序列相符。因此，豬源性成分PCR-電泳檢測技術(shù)在商業(yè)樣本及復(fù)雜食物樣本的檢測中具有較高的準(zhǔn)確性；另外，市場上存在牛肉制品摻假豬肉的現(xiàn)象，肉制品摻假確實(shí)是食品行業(yè)的一項重要問題。

4 結(jié)論

本研究將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和瓊脂糖凝膠電泳檢測相結(jié)合，建立了一種豬源性成分PCR-電泳檢測技術(shù)。該方法對豬源性成分的檢測具有較高的靈敏度和特異性，同時可用于商業(yè)樣本及復(fù)雜食物樣本的檢測，有望用于發(fā)展中國家和基層實(shí)驗(yàn)室開展動物源性成分的快速檢測。另外，該方案可以根據(jù)其他物種特異基因進(jìn)行修改，建立不同動物成分的PCR-電泳檢測技術(shù)，在肉及其制品的摻假、溯源中發(fā)揮重要的作用。

圖1 豬源性成分特異性結(jié)果

圖2 豬源性成分靈敏性結(jié)果

表1 肉制品中豬源性成分的檢出結(jié)果

[1]王海鵬.17.5噸假牛肉全是用豬肉做的 [N].西安晚報,2013-9-12(08).

[2]王瑞元,巢強(qiáng)國,葛宇,等.奶糖中豬成分明膠PCR鑒定方法的研究[J].食品工業(yè),2010(1)：86-88.

[3]李巧玲，劉景艷.市場鮮豬肉摻假狀況的調(diào)查監(jiān)測[J].食品科學(xué)，2004，25（10）：273-276.

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