耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥現狀及整合子耐藥基因分析*

袁 利　徐羽中*　程明剛　劉香萍　李小永

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是院內獲得性感染最為常見的一種條件致病菌，全球廣泛流行，且感染率和耐藥率呈逐步上升趨勢，給臨床抗感染治療帶來挑戰[1-2]。PA可引起醫院獲得性肺炎、菌血癥、尿路感染、傷口感染、繼發性腦膜炎，亦可引起腹膜炎、心內膜炎及結膜炎等[3]。碳青霉烯類抗菌素是一類非典型的β-內酰胺類藥物，因其抗菌譜廣、對各種革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陰性桿菌和多數厭氧菌都具有強大的抗菌活性，且與頭孢菌素類藥物不存在交叉耐藥性，對頭孢菌素耐藥的細菌仍有活性而成為臨床上治療PA感染最常用的抗菌素之一。但近年來，隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用或濫用，導致耐碳青霉烯類PA菌大量產生，給臨床抗感染治療帶來了新的挑戰[4]。為此，本研究對深圳寶安區93株耐碳青霉烯類PA耐藥現狀及整合子耐藥基因進行研究。

1　資料與方法

1.1　菌株來源

收集2015年10月至2017年5月深圳市寶安區人民醫院臨床分離的耐碳青霉烯類PA93株，其中痰液30株，血液27株，尿液13株，胸腔積液15株，分泌物8株，同一患者不同時期的標本僅納入第1次采集的標本。

1.2　儀器與試劑

采用VITEK-2型全自動細菌生化鑒定和藥敏分析儀和Vitek 2 compact系統(法國梅里埃公司)；StepOne實時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)分析儀(美國AB公司)。DNA marker、PCR擴增試劑盒(大連寶生物有限公司)；DNA Marker DL2000引物(上海Invitrogen公司合成)；16種抗菌藥物均為英國OXOID公司產品；MH瓊脂平板(廣州市迪景微生物科技有限公司)；PowerPac Basic電泳儀和Laboratovies 6000凝膠成像系統(美國Bio－Rad公司)。

1.3　試驗方法

1.3.1藥敏試驗

采用K-B法測定耐碳青霉烯類PA對16種抗菌藥物的敏感性，以大腸埃希菌(ATCC25922)和PA(ATCC27853)作為藥敏質控菌，結果判斷參照美國臨床和實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2011版標準進行。

1.3.2改良Hodge試驗

采用直接菌落懸液法制備大腸埃希菌ATCC25922 0.5麥氏濁度菌懸液，用8.5 g/L氯化鈉溶液按1∶10比例進行稀釋，然后涂在MH瓊脂平板上，干燥3～10 min后在中央貼美洛培南紙片。用無菌拭子挑3個待測菌菌落或者質控菌懸液，從紙片邊緣到平板邊緣劃直線的方式接種，37 ℃培養20 h。與大腸埃希菌抑菌環交接產生向抑菌圈內增強生長現象為產碳青霉烯酶陽性菌株。

1.3.3超廣譜β-內酰胺酶檢測

將待測菌制成0.5麥氏濁度，均勻涂在MH平板上，干燥3～10 min，貼頭孢他啶和(或)克拉維酸、頭孢他啶、頭孢噻肟和(或)克拉維酸等藥敏片，于37 ℃孵育18 h。任一復合紙片抑菌環直徑與單一紙片抑菌環直徑相比≥5 mm，則為產超廣譜β-內酰胺酶。

1.3.4整合子耐藥基因檢測

(1)細菌DNA提取。挑取單個菌落于1.5 ml生理鹽水中，35 ℃孵育過夜，12000 rpm，離心5 min后去上清液，使用細菌DNA提取試劑盒進行基因組DNA小量純化，操作嚴格按試劑盒說明書進行。PCR反應體系為50 μl，其中Premix Taq 25 μl，DNA模板3 μl，20 μmol/L的引物2 μl，滅菌蒸餾水20 μl。

(2)擴增條件。94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s→55 ℃30 s→72 ℃1 min→30個循環后→72 ℃ 10 min。擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠，在5 V/cm環境下電泳30 min，后用Laboratovies 6000凝膠成像系統分析結果。

1.4　統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理，計數資料以率(%)表示，組間比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　藥敏結果

在93株耐碳青霉烯類PA中，對16種抗菌素藥物耐藥率＜60%以上的占43.75%，其中最高的為復方新諾明和氨芐西林和(或)舒巴坦，耐藥率分別為97.0%和95.0%，其次為替卡西林和甲氧芐啶和(或)磺胺甲惡唑，耐藥率分別為85.0%和82.0%，耐藥率最低的為多粘菌素E，為11.0%，其次為亞胺培南和美洛培南，耐藥率分別為20.0%和23.0%，見表1。

表1　93株PA對16種抗菌素的耐藥率(%)

2.2　PA碳青霉烯酶及β-內酰胺酶檢測結果

改良Hodge法檢測93株PA中的碳青霉烯酶陽性菌株75株，陽性率為80.7%，β-內酰胺酶陽性菌株53株，陽性率為57.0%。改良Hodge法與PCR比較，檢測碳青霉烯酶存在假陽性和假陰性，但差異均無統計學意義，見表2。

表2　改良Hodgo法與PCR檢測碳青霉烯酶結果比較[株]

2.3　PA整合子耐藥基因檢測結果

在93株PA整合子耐藥基因檢測中，陽性率最高的為blaSHV-11基因(占81.7%)，其次為blaKPC-2基因(占63.4%)；基因陽性率最低的為blaSHV-142和blaIMP-4基因，分別為2.2%和4.3%；3株同時檢出blaKPC-2和blaTEM-1基因，1株同時檢出blaCTM-M-14基因和blaCTM-M-65基因，78株同時檢出3種及以上耐藥基因，見表3，如圖1所示。

表3　93株PA整合子耐藥基因陽性率

圖1　部分耐藥基因凝膠電泳圖

3　討論

PA是院內獲得性感染最為常見的一種條件致病菌，屬非發酵革蘭陰性桿菌，常導致皮膚軟組織、呼吸道、泌尿道、生殖道及院內等感染，呈全球性流行。有關研究結果顯示，PA感染率為10.3%，僅次于大腸埃希菌，居第2位[5]。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌素的廣泛應用及侵入性診療手段的普及，PA感染率及耐藥率呈逐年上升趨勢，已成為院內感染主要病原菌，甚至對碳青霉烯類抗菌素產生了多重性耐藥，給臨床抗感染治療和控制院內感染帶來了極大的挑戰[6-7]。因此，不同地區對耐碳青霉烯類PA的耐藥性和整合子耐藥基因進行研究，分析其耐藥機制，對指導臨床科學用藥和控制院內感染具有重大的臨床意義[8-9]。

碳青霉烯類抗菌素是由改變青霉素結構而研發的一類β-內酰胺類藥，殺菌機理主要通過抑制細菌細胞壁合成粘肽酶，即青霉素結合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)的合成，進而阻止細胞壁粘肽的合成導致細菌細胞壁缺損、通透性增加、菌體膨脹、胞漿滲透壓改變和細菌溶解等途徑殺滅細菌。同時，碳青霉烯類抗菌素殺菌作用具有選擇性，對宿主細胞毒性小而廣泛應用于臨床抗感染治療。

碳青霉烯類抗菌素因抗菌譜廣和抗菌活性強、殺菌效率快、能減少細菌內毒素的釋放、對β-內酰胺酶[如頭孢菌素酶(cephalosporin enzyme，AmpC)具有高度的穩定性、對腸桿菌科細菌具有高度的敏感性、療效肯定及能血液透析清除[10-11]等優點而廣泛用于臨床抗感染治療，是治療PA感染首選藥物。但近年來，隨著碳青霉烯類抗菌素廣泛使用和濫用，耐藥菌逐漸出現并可見多重耐藥菌株，對第3代、4代頭孢和亞胺培南在內的多種β內酰胺類及氨基糖苷類抗菌素產生了耐藥，且呈逐年上升的趨勢[9-12]。本研究結果顯示，深圳寶安地區93株耐碳青霉烯類PA對16種抗菌素耐藥率與國內外有關文獻報導相一致，表明本地區PA對碳青霉烯類抗菌素耐藥情況非常嚴重，應引起當地醫療機構高度重視。

β-內酰胺酶陽性可引起PA對青霉素類、頭孢菌素類等β-內酰胺酶類藥耐藥，而碳青霉烯酶陽性可引起PA對碳青霉烯類藥耐藥。本研究結果顯示，深圳寶安地區93株PA碳青霉烯酶陽性率達到80.7%，超廣譜β-內酰胺酶陽性率為57.0%，表明了碳青霉烯酶陽性和(或)超廣譜β-內酰胺酶陽性是導致本地區PA對碳青霉烯類抗生素產生耐藥的主要原因之一。

整合子是PA對碳青霉烯類抗菌素產生耐藥的一個新的耐藥基因傳播元件，由5保守區、3保守區及兩者之間的可變區構成，整合子對PA的耐藥和多重耐藥的形成起著重要作用[16-18]。其中，blaSHV基因是編碼β-內酰胺酶的基因，可引起PA對青霉素類、頭孢菌素類等β-內酰胺酶類藥耐藥；blaVIM和blaIMP基因是編碼碳青霉烯酶的基因，可引起PA對碳青霉烯類藥耐藥；aadA是編碼氨基糖腺苷轉移酶的基因及aadB是編碼氨基糖苷類乙酰基轉移酶的基因，可引起PA對慶大霉素、妥布霉素的耐藥。本研究結果顯示，深圳寶安區93株PA整合子耐藥基因陽性率最高的為blaSHV-11和blaKPC-2基因，陽性率最低的為blaSHV-142和blaIMP-4基因；3株同時檢出blaKPC-2和blaTEM-1基因，1株同時檢出blaCTM-M-14和blaCTM-M-65基因，78株同時檢出3種及以上耐藥基因，表明了PA產生整合子耐藥基因也是本地區PA對碳青霉烯類抗菌素產生耐藥的重要原因之一。

深圳寶安地區PA對碳青霉烯類抗菌素耐藥情況比較嚴重，耐藥機制復雜，同一地區流行的耐藥菌株具有相似的基因型及耐藥基因。因此，不同地區應進行耐碳青霉烯類PA耐藥情況和耐藥基因檢測，根據藥敏結果以及感染部位的血藥濃度等合適選擇抗菌素規范化使用，減少耐藥菌株的產生[19]。

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