擬莖點霉B3對稻稈-豬糞-蘑菇渣堆肥腐熟進程與品質的影響

孫　旭， 郝玉敏， 蔡金傍， 戴傳超

(1.南京大學生命科學學院，江蘇南京 210023； 2.環境保護部南京環境科學研究所，江蘇南京 210042；3.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046)

我國農業廢棄物種類繁多且數量巨大，其中農作物秸稈年產量約為7×108t，秸稈中含有大量的有機質及微量元素，是一種綜合利用價值較高的可再生資源[1]。但目前我國秸稈利用方式相對粗放，除直接還田以及作為燃料、飼料外，每年約有2×108t秸稈未經處理在田間堆放或焚燒，造成巨大的資源浪費和環境污染[2]。

堆肥是農業秸稈減量化和資源化最為經濟有效的方式之一，但由于秸稈中含有大量的木質素、纖維素和半纖維素等難降解成分，導致自然堆肥腐熟時間長、產品質量差，不利于高效利用秸稈[3-4]。研究表明，接種外源功能微生物可以有效地促進木質素等物質的降解，加快堆肥腐熟進程，提高發酵物肥力[5-7]。

內生真菌生長在植物內部，它對植物的侵染過程也是水解木質素和纖維素的過程，研究表明部分內生真菌可降解纖維素并產生油脂，對植物凋落物具有較強的降解能力[8]。史央等從重陽木中分離出1株植物內生真菌擬莖點霉B3，可離開宿主存活于土壤中，該B3菌能分泌漆酶，促進土壤纖維素酶活性，加快茅蒼術凋落物和花生秸稈的降解[9-11]。本研究以擬莖點霉B3為外源接種菌劑，研究其對稻稈豬糞堆肥進程及產品質量的影響，以期為農業廢棄物資源化利用提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

試驗所用水稻秸稈為江蘇省農業科學院提供的長度為 1～2 cm 的干碎料；豬糞采自鎮江三明生物工程有限責任公司的新鮮豬糞；蘑菇渣為金壇阿波羅生物制品有限公司提供的金針菇發酵物，3種物料的基本特性如表1所示。植物內生擬莖點霉屬菌株B3(Phomopsisliquidambari)分離自重陽木；水堇種子購于江蘇宿遷鑫巖花卉園。

表1　3種試驗物料的基本性質

1.2　稻稈豬糞腐熟試驗

擬莖點霉B3菌劑制備：擬莖點霉B3以馬鈴薯葡萄糖液體培養基培養，500 mL三角瓶中固體發酵培養基質麩皮 ∶糠 ∶稻殼=6 ∶3 ∶1(質量比)，按料液比1 g ∶1.2 mL加入滅菌水。擬莖點霉B3菌液以10.0%接種量接入固體培養基中，攪拌均勻后在28.0 ℃條件下靜置培養1周，有效活菌數達到 104CFU/g。

堆肥試驗于2012年12月13日至2013年1月14日進行。采用6個口徑為27.0 cm、高為20.0 cm的花盆進行試驗，每個花盆內含500 g水稻秸稈，300 g蘑菇渣，300 g豬糞，混勻后碳氮比約為28.0。隨機選取3個花盆作為B3處理組，分別加入 150 g 的B3固體發酵物，另設3個不加任何處理的空白對照組(CK)。加入一定量蒸餾水，調節含水率在70.0%左右，進行好氧高溫發酵，堆肥時間設為32 d。從堆肥當天開始每8 d從堆體取100 g左右樣品，一部分樣品用自封袋密封，保存于4.0 ℃冰箱中，用于E4/E6值、種子發芽指數和微生物數量的測定；另一部分樣品于105.0 ℃條件下烘干粉碎過 0.8 mm 篩，用于測定有機質、營養成分、木質素、纖維素的含量。

1.3　測定方法

E4/E6值測定方法[12]：稱取2.5 g堆肥樣品于50 mL離心管中，加入25 mL蒸餾水，離心后取上清液，用分光光度計分別在465、665 nm處測定吸光度，計算其比值。

種子發芽指數測定[13]：稱取5 g鮮樣放于三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，充分振蕩，30 ℃條件下浸提24 h，過濾取6 mL濾液加到鋪濾紙的培養皿中，將10粒水堇種子置于其中，室溫條件下放置48 h，每個處理重復3次，同時以蒸餾水為對照，測定發芽指數。

有機質含量采用重鉻酸鉀氧化法[14]測定；全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀含量參照土壤測試方法[15]測定；木質素含量采用濃硫酸法[16]測定；纖維素含量采用改進的濃酸水解定糖法[16]測定；微生物數量采用平板稀釋法[14]測定。

1.4　數據分析

試驗結果以算術平均數±標準誤表示，采用SPSS 13.0軟件進行數據方差分析(One-way ANOVA)檢驗處理間的差異顯著性。Duncan’s法進行多重比較。

2　結果與分析

2.1　稻秸豬糞發酵物有機質含量變化

由圖1可知，不同處理堆肥過程中有機質含量整體呈下降趨勢。接種擬莖點霉B3能夠促進有機質的分解，在堆肥升溫期和高溫期(0～16 d)微生物代謝活動較旺盛，有機質被大量分解。在16 d時，CK和B3處理堆肥中有機質含量分別為483.6、362.2 g/kg，比開始時減少18.0%(P<0.05)和 44.3%(P<0.01)；在后腐熟階段，大部分易降解有機質被分解，微生物活性減弱，有機質降解速率變慢并趨于穩定，在 32 d 時CK和B3處理分別比開始時有機質含量減少21.2%(P<0.01)和44.3%(P<0.01)。表明接種外源功能微生物可以促進稻稈豬糞堆肥有機物質的降解，加快堆肥反應進程。

2.2　稻稈豬糞發酵物E4/E6值的變化

在降解過程中稻稈豬糞產生了大量的腐殖酸，其含量是堆肥腐殖化的一個重要指標，可用來判斷堆肥腐熟程度。堆肥腐殖酸在465、665 nm處具有特征吸收峰，其在465、665 nm處吸光度比值(E4/E6)通常被用來反映腐殖質的縮合和芳構化程度，通常E4/E6比值越低，腐殖化和聚合程度越高，分子量越大。由圖2可知，接種B3處理堆肥E4/E6值呈先上升后下降的趨勢，在8 d時達到最大值3.0，之后迅速下降，在24 d時B3處理堆肥中E4/E6值為1.6，比開始時下降43.9%，此時降解物的芳構化程度較高，形成大量的腐殖質。接種B3處理堆肥E4/E6值較CK低(P<0.01)，結果表明，添加菌劑能促進腐殖質的縮合和芳構化，加快稻稈腐殖化，形成更加穩定的腐殖質。

2.3　稻秸腐熟過程中纖維素、木質素含量的變化

水稻秸稈主要由纖維素、半纖維素、木質素組成，含量分別在36.7%、24.8%、25.2%左右，這類物質不易降解，導致自然堆肥腐熟時間較長、堆肥產品質量差，不利秸稈的高效利用。

2.3.1纖維素含量變化由圖3可知，在腐熟過程中B3處理的纖維素含量一直在下降，而纖維素的降解率持續上升。在前16 d內纖維素降解較快，CK和B3處理的纖維素含量分別下降15.3%、39.2%。堆肥結束時對照和B3處理堆肥中纖維素含量分別為24.3%、16.7%，分別比開始時下降30.7%、50.5%，表明接種B3菌有利于纖維素的降解。

2.3.2木質素含量變化水稻秸稈腐熟過程中木質素的降解最為緩慢。由圖4可知，對照組木質素的含量一直在下降，從開始的25.7%降至32 d的17.2%，下降 33.1%；接種B3處理堆肥中木質素經16 d的降解，含量從開始的24.1%降至15.1%(P<0.01)，下降37.3%，后16 d降解較為緩慢。表明內生擬莖點霉B3在水稻秸稈木質素降解過程中起了很大的作用。

2.4　稻秸腐熟過程中微生物數量的變化

堆肥是以微生物為媒介的復雜生化過程，細菌、真菌、放線菌在有機質的降解中發揮著重要作用，其數量在堆肥的不同階段是不同的。

2.4.1細菌數量變化細菌是堆肥腐熟過程中數量最多的微生物，可快速分解糖類、淀粉和蛋白質類易降解物質，部分細菌也參與纖維素的分解，進行自身生長代謝和產生熱量。由圖5可知，除B3處理32 d堆肥樣品外，不同處理堆料中細菌數量呈先上升后下降的趨勢。堆肥升溫期，堆料中易降解物質較多，細菌迅速繁殖，在堆肥高溫期，大多數細菌死亡，細菌數量降低，接種B3處理比對照處理的堆料中細菌數量多。堆肥開始時B3處理和對照的細菌數量分別為3.2×109、1.8×109CFU/g，分別在8、16 d時達到最大值，分別為5.5×109CFU/g和3.2×109CFU/g，接種B3處理細菌數量比對照處理高71.9%。表明接種外源功能菌B3有利于細菌的生長，能加速堆肥發酵的啟動，促進有機質的降解。

2.4.2放線菌數量變化稻稈豬糞堆肥腐熟過程中放線菌的數量低于細菌和真菌，呈現先上升后下降的趨勢。由圖6可知，在堆肥前期放線菌數量逐漸升高，接種B3處理放線菌數量在8 d時達到最大值，為3.8×108CFU/g，比對照放線菌數量高65.2%(P<0.05)；在高溫期放線菌數量維持在一個較高的水平，而在降溫期放線菌數量持續下降。研究表明，在高溫期纖維素和木質素的分解主要由放線菌完成，其數量和種類也會有所增加[17]。接種內生擬莖點霉B3明顯增加堆肥腐熟過程中放線菌數量，產生更多的木質纖維素分解酶類，加速木質素的降解，從而促進水稻秸稈的腐熟。

2.4.3真菌數量變化堆肥腐熟過程中真菌數量的變化趨勢與細菌相似，但數量低于細菌。由圖7可見，在堆肥前期真菌數量持續升高，接種B3處理真菌數量在8 d時達到最大值，為2.6×109CFU/g，比對照真菌數量高83.8%(P<0.05)；在高溫期大部分真菌處于休眠狀態或死亡，導致其數量急劇下降；在堆肥結束時接種B3處理真菌數量達到 2.6×108CFU/g，比對照真菌數量高25.7%(P<0.05)，且低于堆肥起始的真菌數量。

2.5　稻秸豬糞發酵物對種子發芽指數的影響

種子發芽指數(germination index，簡稱GI)常被用來測定堆肥的生物毒性，它是表征堆肥腐熟水平的重要生物學指標之一。一般認為，當GI大于50.0%時，可認為堆肥發酵物對作物基本無毒性，堆料基本腐熟；當GI大于80.0%時，堆料已沒有植物毒性且已腐熟。由圖8可知，不同處理的堆肥發酵物GI呈先下降后上升的趨勢。堆肥開始時有機質未分解，對植物抑制作用小，B3和CK的GI分別為87.0%、77.0%(P<0.05)，由于接種B3后加快了有機質的降解，產生了較多的有毒物質(氨和低級脂肪酸等)，抑制了水堇種子的發芽，在 8 d 時B3處理的GI為63.0%，低于CK的73.0%。隨著堆肥的進行，有毒物質減少，16 d時B3處理堆肥GI達到80.0%，顯著高于CK處理的67.0%(P<0.05)，表明堆肥已達到腐熟狀態，堆肥結束時B3處理和CK處理堆肥GI分別為83.0%和77.0%。結果表明，接種擬莖點霉B3有助于降低堆肥發酵物植物毒性，加快堆肥腐熟進程。

2.6　稻稈豬糞發酵物養分含量的變化

堆肥過程是一個復雜的生物化學過程，伴隨著有機物的降解及氮、磷、鉀的釋放和固定，氮、磷、鉀的含量直接影響最終堆肥產品質量。堆肥產品的養分含量是評價堆肥產品質量的標準之一。水稻秸稈和豬糞經過32 d好氧高溫堆肥后，不同處理的堆肥產品品質有所差異，接種擬莖點霉B3能明顯提高堆肥產品中養分含量。由表2可知，B3處理堆肥中全氮和速效氮含量分別增加23.7%(P<0.05)和19.9%(P<0.05)；全磷和速效磷含量分別增加33.3%(P<0.05)和 35.3%(P<0.05)；全鉀和速效鉀含量分別增加14.3%(P>0.05)和9.2%(P>0.05)。

表2　堆肥產品養分含量

注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

3　結論與討論

堆肥是在微生物的作用下，將復雜的有機物分解為細胞可利用的小分子物質，并形成穩定腐殖質的過程。自然堆肥腐熟時間長、產品質量差，不利于農業廢棄物的高效利用，微生物接種技術具有使堆體快速升溫、無二次污染、提高堆肥質量的優點，因此被廣泛應用在堆肥中[3]。大量的研究表明，接種微生物菌劑能增加堆肥初期微生物數量，提高微生物代謝活性，加快有機物的降解，促進堆料的腐熟，例如在堆肥初期接種芽孢桿菌和鏈霉菌，可在堆肥過程中增加細菌數量，加速有機質分解[18]；接種EM菌劑(effective microorganisms)有利于堆肥礦化作用，縮短堆肥腐熟時間5～8 d[19]。

擬莖點霉B3是從重陽木中分離得到的1株植物內生真菌，可離開宿主在土壤中存活30 d，能與大多數微生物形成互利共生關系[10]。該B3菌能分泌降解木質素的關鍵酶——漆酶，粗酶液經50 ℃處理1 h后，仍能保持83.1%的活性，且pH值在6～8時，酶活較為穩定，從而促進堆肥過程中木質素和纖維素的分解[11，20]。當環境中可利用的營養物質匱乏時，擬莖點霉B3可被誘導產生纖維素酶和木質素酶，加快茅蒼術凋落物和花生秸稈的降解[10，21]。本研究在稻稈豬糞堆肥初期接入有效活菌數為104CFU/g的擬莖點霉B3菌劑，結果表明，與對照相比，接種擬莖點霉B3菌劑能增加堆肥升溫期和高溫期細菌、真菌、放線菌的代謝活性和細胞數量，其中有些放線菌能產生木質纖維素的分解酶類，例如放線菌(Streptomycessp.)在以秸稈為唯一碳源時能產生大量的纖維素酶，在70 ℃時仍具有較高的酶活性[22]；在牛糞堆肥中存在大量的高溫放線菌GPL 1可產生完整的纖維素酶系，對甘蔗、濾紙、微晶纖維素等均具有較好的降解作用，從而促進有機質、木質素、纖維素的降解，形成更加穩定的腐殖質[23]。種子發芽指數是評價堆肥腐熟效果和生物毒性的關鍵指標，接種擬莖點霉B3的處理在16 d時種子發芽指數達到 80.0%，遠高于對照的67.0%，表明堆肥完全腐熟且無生物毒性。因此，接種擬莖點霉B3能加快堆肥腐熟進程，縮短腐熟時間。

堆肥過程中有機物被不斷分解，同時由于含水率的下降，堆體中無機營養成分會產生“濃縮效應”，使養分相對含量增加，有利于提高堆肥產品質量。接種擬莖點霉B3菌劑的處理經32 d腐熟后，堆體中全氮、速效氮、速效磷含量顯著增加，與前人研究結果[24]一致。有一些菌種雖然對秸稈的降解能力強，但同時也是植物致病菌，不能作為秸稈腐熟菌劑，研究表明，擬莖點霉B3不僅對水稻、大豆、花生等作物生長無毒害作用，還能促進水稻分蘗、大豆結瘤、緩解花生連作障礙等[9，25-26]。

稻稈豬糞在自然堆肥過程中，有機質、纖維素、木質素降解緩慢，形成穩定腐殖質的時間長，堆肥產品養分含量和種子發芽指數較低，腐殖化進程較慢。向稻稈豬糞高溫堆肥中添加內生擬莖點霉B3菌劑，能增加堆肥升溫期和高溫期微生物的數量，加速有機質、纖維素、木質素的降解，縮短腐殖質的形成時間，提高堆肥產品中全氮、全磷、全鉀、速效氮、速效磷、速效鉀含量，提高種子發芽指數，減少對植物生長的抑制，提升堆肥產品品質。

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