互葉白千層內生真菌鑒定及耐精油菌株篩選

余　波， 傅科鶴， 杜尚廣

(南昌師范學院生物系，江西南昌 330032)

植物內生菌是一類廣泛分布在植物組織內，對植物不產生明顯病理影響的微生物類群，而國內外對植物內生菌的詳細研究始于20世紀80年代[1]。絕大部分內生菌的生活史都在植物體內完成，而植物體內是一個相對封閉的內環境：充足的養分、適當的氧氣、少量的競爭對手。在植物-內生菌長期共生過程中，內生菌能夠利用環境中的前體物質合成與植物相似的次生代謝產物，這種特性在一些重要的藥用植物中顯得尤其重要和有意義。如傅科鶴等從產抗癌藥物紫杉醇的紅豆杉內生真菌中分離得到1株曲霉屬內生真菌，從其發酵產物中獲得5種化學成分，其中一種對腫瘤細胞有明顯的抑制作用[2]。在我國，圍繞藥用植物內生菌的生理活性物質研究是當前的熱點。

互葉白千層(Melaleucaleucadendron)是桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬(Melaleue)的一種多年生常綠小灌木，原產于澳大利亞東部的昆士蘭州和新南威爾士州的北部海岸一帶。20世紀80年代后，我國、印度和東南亞的一些國家開始引種。互葉白千層新鮮枝葉提取得到的精油俗稱茶樹精油，它是一種廣譜的殺菌劑，其產品廣泛應用于化妝、醫藥、食品等行業，具有較高的經濟價值[3]。茶樹精油的廣譜抑菌特性，使其在替代化學農藥方面具有較大的應用潛力[4]。目前，研究認為茶樹精油通過破壞膜結構[5]，抑制微生物呼吸途徑中線粒體酶、脫氫酶的活性，從而影響細胞呼吸作用[6]、干擾胞內大分子物質活性[7]等形式達到殺菌作用。然而，對于其詳細的殺菌機制研究還不足。由于長期與植物共生，互葉白千層內生真菌對精油都具有一定的抗性。從中篩選高耐受精油的菌株具有更大的概率，可以縮短篩選周期，提高效率。因此，本研究從互葉白千層內生真菌中篩選高耐受精油的真菌，并對互葉白千層內生真菌的多樣性進行初步分析。后期將挑選同屬內抗性強弱有明顯差異的2株菌株進行比較基因組學及轉錄組的研究，從分子水平上解釋茶樹精油的抑菌機制，深化對茶樹精油抑菌作用機制的理解，為更高效地利用茶樹精油抑菌提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1植株及精油互葉白千層采自江西省撫州地區，4-松油醇型；互葉白千層精油經蒸餾法提取所得。

1.1.2試劑氨芐青霉素、鏈霉素購自Amresco公司，配成100 mg/mL，0.45 μm濾膜無菌過濾，分裝成小管，-20 ℃凍存備用。

1.1.3培養基PDA培養基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂15 g，水1 L。

馬丁氏培養基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1%孟加拉紅水溶液 3.3 mL，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1.0 L。

查氏培養基：NaNO33.00 g，K2HPO4·3H2O 1.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，KCl 0.50 g，FeSO40.01 g，蔗糖 30.00 g，瓊脂15.00 g，蒸餾水1.00 L。

1.2　方法

1.2.1內生真菌分離、純化分別取互葉白千層的根、莖、葉部位，用清水洗凈后置于紗布上晾干；在無菌操作臺上，將根、莖、葉浸沒于裝有20%次氯酸鈉的培養皿中2 min，然后轉移至無菌水中漂洗1 min，再轉至70%乙醇中30 s，最后用無菌水漂洗1 min；表面消毒處理后的樣品轉至無菌濾紙上，吸干水分后剪成1 m3大小的組織塊，接種于含抗生素的孟加拉紅培養基上，每皿間隔放置10個樣品，28 ℃倒置培養，及時將生長的菌株轉移至新的培養基。

1.2.2抑菌試驗茶樹精油用甲醇稀釋到35%(體積分數)的濃度后，取200 μL涂布于PDA平板(直徑8.5 cm)上，晾干10 min后，接種內生真菌菌餅(直徑0.5 cm)，每皿接5個，重復3次，28 ℃倒置培養，及時測量菌落直徑，以甲醇作為空白對照。

1.2.3真菌鑒定

1.2.3.1形態學鑒定挑取活化后的真菌菌絲，分別接種于PDA與察氏培養基中培養，肉眼觀察菌落正反面形態特征；采用插片法及玻璃紙法進行孢子形態觀察，參照《真菌鑒定手冊》進行菌種形態學鑒定。

1.2.3.2分子生物學鑒定采用CTAB法提取真菌基因組DNA后，通過ITS1～ITS4引物對擴增后，測序，NCBI比對后鑒定菌種。

2　結果與分析

2.1　互葉白千層內生真菌的分離鑒定

由表1可知，共分離純化獲得內生真菌149株，其中根中分離到35株，莖中分離到102株，葉中分離到12株。經形態學鑒定，共分為鏈格孢屬、青霉屬、曲霉屬、炭疽屬、鐮孢霉屬、木霉屬等6屬。其中根部主要是鐮孢霉屬、木霉屬等土壤習居種類占優勢；莖部優勢菌群為鏈格孢屬，且總體數量最多；葉部菌群種類較單一，數量很少，主要是炭疽屬與鏈格孢屬2類。

表1　互葉白千層內生真菌鑒定

2.2　耐受茶樹精油內生真菌篩選

2.2.1抑菌精油濃度的確定茶樹精油具有廣譜的抑菌效果，對細菌、真菌都有明顯的抑制能力。然而，不同來源及不同萃取手段獲得的精油抑菌IC50是不同的。為了確定合適的抑菌濃度，設置3種不同的精油濃度(甲醇溶解)——15%、35%、50%，隨機挑選40株內生真菌進行最佳濃度確定。表2結果表明，50%濃度過高，只有1株(2.5%)菌株能夠生長，獲得耐受菌株的數量過少，不利于后續研究；15%濃度偏低，32株菌株(80%)都能夠生長，與不加精油的培養基(對照)相比，只有3株受到10%以上的抑制；35%濃度有5株菌株(20%)能夠生長，完全不受抑制的有2株。綜合考慮篩選數量與濃度的關系，挑選35%的精油用于耐受菌株的篩選。

表2　抑菌精油濃度的確定

注：抑制率=(對照培養基菌落直徑-對應的精油培養基菌落直徑)/對照培養基菌落直徑×100%。

2.2.2耐受精油內生真菌篩選通過精油抗性篩選，從149株內生真菌中篩選得到5株能夠在含35%精油的PDA平板上正常生長的菌株(表3)。其中編號為Ml10的菌株抗性最強，生長4 d后菌落直徑可達到5.30 cm，顯著高于其他4株菌株(P<0.05)。

表3　互葉白千層內生真菌耐精油菌株篩選

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　耐受精油菌株鑒定

2.3.1菌株Ml10形態學鑒定菌株Ml10在PDA平板上生長迅速，4 d即長滿平板并開始產孢。菌落初期為白色，氣生菌絲發達，菌落中間由內到外產綠色孢子，菌落背面無色。孢子梗環狀排列，主枝樹狀，分枝多，瓶梗短，基部細，分生孢子球形(圖1)。菌株Ml10初步鑒定為康寧木霉(Trichodemakonigii)。

2.3.2菌株18S rDNA鑒定通過CTAB法提取菌株Ml10的DNA(圖2-A)，然后以引物ITS1F/ITS4R擴增其ITS序列(圖2-B)。結果表明，擴增片段為610 bp；通過測序后NCBI比對分析，該菌株與康寧木霉的ITS序列100%配對，結合形態學鑒定結果，確定該菌株為康寧木霉。

3　結論與討論

本研究分離獲得的菌株Ml10來自互葉白千層的根部，通過形態學鑒定后屬于木霉屬真菌。木霉菌屬于土壤常見的生防菌，在多種植物根部都有定植現象[8]。由于長期定植在互葉白千層根部，內生菌對精油具有明顯的抗性[9]。后期研究將通過比較基因組學、蛋白質組學及代謝組學技術，從DNA和蛋白質水平分析這些菌株抗茶樹精油的機制，從而可以補充和完善茶樹精油抑制真菌機制理論，為更高效地利用茶樹精油提供理論依據[10]。

參考文獻：

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