紫外線對小麥葉銹病病菌流行學(xué)因素的影響

許換平， 郭慧杰， 張　林， 閆紅飛， 孟慶芳

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000)

由專性寄生菌小麥隱匿柄銹菌(Pucciniatriticina)引起的小麥葉銹病是小麥生產(chǎn)上的重要病害之一，是世界上分布范圍較廣的病害，一般造成產(chǎn)量損失5%～45%，有時甚至更高[1]。我國曾在1969年、1973年、1975年、1979年、1990年發(fā)生流行小麥葉銹病[2]。2015年、2016年，筆者所在研究室的人員在采集小麥葉銹病病菌標(biāo)樣的過程中發(fā)現(xiàn)，小麥葉銹病發(fā)病率較高，尤其是2015年的發(fā)病率較高，發(fā)病面積較廣。尤其是在淮河以南地區(qū)，小麥葉銹病發(fā)病早，嚴(yán)重度高，嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量。

小麥葉銹病在我國的侵染循環(huán)包括越夏、秋苗發(fā)病、越冬、春季流行等4個過程。小麥葉銹病病菌可以產(chǎn)生性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子、擔(dān)孢子等5種孢子，其中夏孢子在病害循環(huán)中占有重要的地位，我國小麥葉銹病的發(fā)生主要依靠夏孢子的侵染和傳播，在夏孢子傳播和侵染過程中，環(huán)境條件的改變會影響其存活及病害的發(fā)生情況，特別是紫外線會導(dǎo)致毒性的變化[3-5]和病菌的死亡[6-7]。但由于人為原因?qū)е鲁粞鯇涌斩矗沟玫厍虮砻嫔系淖贤饩€強度越來越強，不斷加強的紫外線會影響植物病原菌、寄主植物和植物病害[8]。當(dāng)前，紫外線已經(jīng)被認(rèn)為是影響植物病害發(fā)生和流行的最重要的環(huán)境因素之一[9-10]。因此，加強研究紫外線對植物病原菌和植物病害的影響，已經(jīng)成為控制植物病害和保證糧食安全的重中之重。紫外線誘變也是獲得銹菌突變菌株的重要手段。Flor等采用紫外誘變的方法，獲得了致病性發(fā)生變化的亞麻銹菌菌株[11-12]。Maddison等研究了自然條件下紫外線對銹病病菌遠(yuǎn)距離傳播的影響[13]。紫外線誘變在條銹病病菌研究中的應(yīng)用較多，商鴻生等通過紫外線誘變獲得了多個毒性發(fā)生突變的菌株[3，14]；黃麗麗等對突變菌株進(jìn)行了隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記遺傳多樣性分析，初步認(rèn)為紫外線可以使小麥條銹病病菌基因組DNA發(fā)生較大的變化[4]。在小麥葉銹病病菌研究中，鹿巍對小麥葉銹病病菌05-5-46單孢菌株進(jìn)行紫外誘變，獲得了3株穩(wěn)定遺傳的小麥葉銹病病菌突變菌株Mut1、Mut2、Mut3[15]。本研究采用紫外誘變法，獲得毒性發(fā)生變異的突變菌株，并進(jìn)一步探究紫外線對小麥葉銹病病菌孢子萌發(fā)和流行學(xué)因素的影響，以期為小麥葉銹病病菌致病性的研究提供材料和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1供試菌株小麥葉銹病病菌單孢菌株12-5-1384-1和誘變菌株1384-10-B-1，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹病研究室保存。其中，單孢菌株12-5-1384-1在鑒別寄主TcLr1上的侵染型為“；”，誘變1384-10-B-1菌株是由菌株12-5-1384-1在1 600 μW/cm2紫外強度下照射10 min后篩選得到，在鑒別寄主TcLr1上的侵染型為“3”。

1.1.2供試小麥品種小麥品種為鄭州5389，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹病研究室保存。

1.1.3試驗時間與地點試驗于2015年11月至2016年5月，在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院分子植物病理學(xué)與生物防治實驗室完成。

1.2　試驗方法

1.2.1誘變劑量及方法取10 mg新鮮的小麥葉銹病病菌夏孢子，置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，保濕水化12 h后，在 1 600 μW/cm2紫外強度下，分別照射10、20、30 min，以未照射處理作為對照，照射后用毛筆收集夏孢子，均勻抖落在1%的水瓊脂培養(yǎng)基(10 g瓊脂粉+1 L蒸餾水)平板上，加蓋后放在20 ℃黑暗環(huán)境中，6 h后顯微鏡下檢查夏孢子的萌發(fā)情況。每個處理隨機檢查300個孢子，以夏孢子芽管長度超過夏孢子直徑一半作為萌發(fā)的記載標(biāo)準(zhǔn)[16]，每個處理重復(fù)3次。計算孢子萌發(fā)率和相對萌發(fā)率，孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%，相對萌發(fā)率=處理組孢子萌發(fā)率/對照組孢子萌發(fā)率×100%。根據(jù)前人對最適誘變劑量的研究，原始菌株的夏孢子經(jīng)紫外線照射后，致死率為90%左右時確定為最適誘變劑量。

1.2.2誘變菌株和原始菌株流行學(xué)研究將10 mg誘變菌株和原始菌株的夏孢子分別水化后，在1 600 μW/cm2紫外強度下分別照射0、10、20、30 min，將處理后的新鮮夏孢子收集于裝有10 mL 稀釋1 000倍的吐溫-20水溶液的小噴壺中，均勻噴灑于鄭州5389小麥幼苗葉片上，葉片旁邊放置載玻片，以觀察記錄單位面積噴灑小麥葉銹病病菌的夏孢子數(shù)。16～20 ℃黑暗保濕14～16 h后，移入16～20 ℃的溫室內(nèi)培養(yǎng)。觀察并記錄流行學(xué)指標(biāo)[潛育期、侵染效率、病斑擴展率、產(chǎn)孢量、病情發(fā)展曲線下面積(area under the disease-progress curve，簡稱AUDPC)等]。試驗設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2.1潛育期的標(biāo)準(zhǔn)將夏孢子接種于葉片至葉片上第1個夏孢子堆突破表皮時的時間為潛育期，在葉片出現(xiàn)褪綠斑后，每天觀察葉片病斑的變化，記錄第1個夏孢子堆突破表皮的時間。

1.2.2.2侵染效率的計算顯微觀察記錄載玻片上單位面積噴灑的夏孢子數(shù)量，作為噴灑于葉片上的單位面積的夏孢子數(shù)量。用毫米尺測量葉片的長度和最寬處的寬度，計算葉片面積。當(dāng)葉片上出現(xiàn)侵染點后，統(tǒng)計葉片上侵染點的數(shù)量，并計算侵染效率。葉片面積=葉片長×葉片寬×0.8；侵染效率=葉片上侵染點數(shù)量/(單位面積接種夏孢子的數(shù)量×葉片面積)。

1.2.2.3病斑擴展率計算在接種夏孢子的葉片剛剛出現(xiàn)孢子堆時，選擇只有單個孢子堆的葉片，用電子游標(biāo)卡尺測量孢子堆的長、寬，并記錄，計算病斑面積，每2 d測1次，直到孢子堆不再擴展為止。

病斑擴展率=(第2天病斑面積-第1天病斑面積)/第1天病斑面積。

1.2.2.4產(chǎn)孢量待葉片上的孢子堆突破表皮后，每2 d收集1次夏孢子，直至不再產(chǎn)生新的夏孢子，將收集的夏孢子懸浮于10 mL無菌水中，用血球計數(shù)板統(tǒng)計每個處理的產(chǎn)孢量。

2　結(jié)果與分析

2.1　紫外線對小麥葉銹病病菌夏孢子萌發(fā)率的影響

由表1可知，在同一紫外線強度下，隨著紫外線照射時間的延長，2種菌株的相對萌發(fā)率均在逐漸降低。處理時間為 0 min 時，菌株12-5-1384-1夏孢子的萌發(fā)率為96.98%，而誘變菌株1384-10-B-1夏孢子的萌發(fā)率僅為72.94%；當(dāng)處理時間為10 min時，菌株12-5-1384-1夏孢子的萌發(fā)率低于誘變菌株1384-10-B-1夏孢子的萌發(fā)率，說明原始菌株對紫外線較敏感。隨著處理時間的延長，2種菌株的相對萌發(fā)率逐漸接近，說明隨著照射時間的延長，突變菌株的抗紫外線能力逐漸降低。

表1　紫外線對小麥葉銹病病菌夏孢子萌發(fā)率的影響

2.2　紫外線對小麥葉銹病病菌流行學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1紫外線對小麥葉銹病病菌潛育期的影響由圖1可知，處理時間為0 min時，菌株12-5-1384-1的潛育期為 9 d，誘變菌株1384-10-B-1的潛育期為7 d，潛育期縮短 2 d；處理時間為10、20、30 min時，菌株12-5-1384-1的潛育期分別為10、10、11 d，每個處理中，誘變菌株1384-10-B-1的潛育期均縮短2 d。隨著處理時間的延長，2種菌株的潛育期均延長，說明紫外線可以延長小麥葉銹病病菌的潛育期。

2.2.2紫外線對小麥葉銹病病菌侵染效率的影響由圖2可知，處理時間為0 min時，菌株12-5-1384-1的侵染效率為30.33×10-5，誘變菌株1384-10-B-1的侵染效率為38.96×10-5，誘變菌株的侵染效率提高了28.45%。處理時間從0 min增加到10 min時，菌株12-5-1384-1的侵染效率降低了89.17%，誘變菌株1384-10-B-1的侵染效率降低了91.13%。隨著處理時間的進(jìn)一步增加，2種菌株的侵染效率均逐漸降低，對照組(處理0 min)與各處理組之間差異顯著(P<0.05)，各處理組之間差異不顯著；處理時間相同時，誘變菌株的侵染效率總是高于原始菌株。

2.2.3紫外線對小麥葉銹病病菌病斑擴展率的影響由圖3可知，菌株12-5-1384-1的病斑擴展率變化較規(guī)律，各處理之間的變化趨勢一致，病斑擴展率均在接種后第11天達(dá)到最高，之后隨著時間的增加，病斑擴展率逐漸降低，至第19天時又出現(xiàn)1個小高峰。菌株1384-10-B-1處理 0 min 組和10 min組的最大病斑擴展率均出現(xiàn)在接種后第13天，且在第17天時又出現(xiàn)1個小高峰；處理20 min組和 30 min 組，最大病斑擴展率均出現(xiàn)在第15天，后期沒有出現(xiàn)小高峰。

2.2.4紫外照射對葉銹病病菌產(chǎn)孢量的影響由圖4可知，處理時間為0 min時，菌株12-5-1384-1的產(chǎn)孢量為 116.39×104個，誘變菌株1384-10-B-1的產(chǎn)孢量為145.46×104個，誘變菌株的產(chǎn)孢量提高了24.98%。處理時間從0 min增加至10 min時，菌株12-5-1384-1和誘變菌株1384-10-B-1的產(chǎn)孢量分別降低了84.11%、83.83%；隨著處理時間的進(jìn)一步增加，2種菌株的產(chǎn)孢量均逐漸降低，對照組(處理0 min)與處理組之間差異顯著(P<0.05)，各處理組之間差異不顯著；處理時間相同時，誘變菌株的產(chǎn)孢量總是高于原始菌株。

2.2.5紫外線對小麥葉銹病病菌AUDPC的影響由圖5可知，隨著接種后時間的延長，各處理的AUDPC均在增加，且對照組(處理0 min)顯著高于各處理組(P<0.05)。就同一菌株而言，接種后相同時間內(nèi)隨著照射時間的延長，菌株的AUDPC逐漸降低。同一菌株接種后相同時間內(nèi)對照組的AUDPC與各處理組之間差異顯著(P<0.05)，各處理組之間差異不顯著。紫外線照射時間相同時，原始菌株12-5-1384-1的AUDPC總是低于誘變菌株1384-10-B-1的AUDPC。

3　結(jié)論與討論

突變是促使病原菌發(fā)生遺傳多樣性變化的基本因素，因此在研究中，對菌株進(jìn)行誘變，篩選突變體是研究致病機制和某些基因功能的基本方法[17-18]。紫外線導(dǎo)致DNA發(fā)生變異的根本在于入射光子的波長[19-23]，紫外線誘導(dǎo)的DNA變異可以由紫外線B或紫外線A吸收，以及光敏作用直接觸發(fā)[19，22，24]，發(fā)生的變異是非定向的，正向的毒性突變是導(dǎo)致抗病品種喪失抗銹性的原因，而反向的非毒性變異在篩選過程中容易丟失。本研究采用紫外誘變的方法，以TcLr1為鑒別寄主，選擇在TcLr1上侵染型為“；”的12-5-1384-1單孢菌株為原始菌株，經(jīng)紫外線誘變后，篩選出侵染型變?yōu)椤?”的菌株，進(jìn)一步研究紫外線對其流行學(xué)參數(shù)的影響。

本研究的結(jié)果表明，紫外線照射會抑制葉銹病病菌夏孢子的萌發(fā)，2株葉銹病病菌對紫外線照射的容忍度是不同的，誘變菌株的容忍度大于原始菌株；在紫外線照射之后，菌株的侵染效率、病斑擴展率、產(chǎn)孢量和AUDPC均下降，潛育期增長，紫外線照射在某種程度上傷害了葉銹病病菌夏孢子，導(dǎo)致一部分夏孢子不能萌發(fā)、甚至死亡，但即便如此，仍有一些幸存的夏孢子能夠萌發(fā)，曾有多名研究者報道過紫外線輻射可以延遲幸存真菌分生孢子的萌發(fā)[25-27]；另外，真菌孢子自身的某些生理條件可能會幫助其抵抗紫外照射的損害并修復(fù)其帶來的傷害[28]，但這個過程需要時間，這可能是處理時間越長，潛育期越長的原因。這些結(jié)果表明，誘變菌株和原始菌株相比，原始菌株對紫外線照射更加敏感，在同樣的紫外線照射條件下，突變菌株更具生存優(yōu)勢。在此研究中突變菌株被命名為誘變菌株1384-10-B-1，自然界中該生理小種的毒性高于單孢菌株12-5-1384-1這一生理小種，近幾年誘變菌株1384-10-B-1出現(xiàn)的比例高于單孢菌株12-5-1384-1，可能是因為誘變菌株1384-10-B-1比單孢菌株12-5-1384-1更適合現(xiàn)在的生存環(huán)境。因此，可以初步認(rèn)為紫外線可能是造成葉銹病病菌生理小種不斷進(jìn)化的一個重要因素，但還須做進(jìn)一步的研究。

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