洛龍黨參與其他川黨參遺傳多樣性的ISSR分析

楊正久， 代建忠， 梁大敏， 毛朝坤， 董紅梅， 馬增鳳

(1.遵義醫(yī)藥高等專科學校醫(yī)學技術系，貴州遵義 563006； 2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530005)

黨參為桔梗科黨參屬植物，川黨參產(chǎn)于四川、貴州、湖南、湖北、陜西等省，歷史悠久，品種較多，已大量人工栽種，不同品種間的性狀與藥用成分含量存在差異。洛龍黨參又名洛黨，產(chǎn)于貴州省道真仡佬族苗族自治縣東北部的洛龍山區(qū)而得名，是川黨參的生態(tài)變種[1]，以其肉質(zhì)鮮嫩、藥用價值高而深受外界青睞。黨參主要成分有多糖、黨參苷、甾醇類、生物堿、內(nèi)酯類、豆素類等，具有益氣生津、補脾養(yǎng)胃的功效，用于脾肺虛弱、氣短心悸、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等病癥[2]。余蘭等研究表明，洛龍黨參的多糖含量達25.6%～27.75%，比其他川黨參高10.97%[3]。

目前分子標記用于黨參種質(zhì)遺傳多樣性的研究較少，利用簡單重復序列區(qū)間(ISSR)分子標記技術對道真洛龍黨參種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究還尚未見報道。本研究利用ISSR技術對道真陽溪和壩羊的洛龍黨參與四川、重慶等地其他川黨參的種質(zhì)遺傳多樣性進行研究，為貴州省遵義市種植黨參品種的鑒定、篩選利用及遺傳改良提供方法和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料及來源

本研究共采用12個黨參品種(表1)，分別來自貴州省遵義道真縣、重慶、湖北及四川種植黨參種子萌發(fā)的嫩葉。選取成熟種子，脫粒去雜，催芽后，置于放有濾紙的培養(yǎng)皿上于 25 ℃ 萌發(fā)，發(fā)芽3～5 cm高時取幼苗嫩葉，置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　儀器與試劑

主要儀器：GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，Eppendorf Mastercycler?普通PCR儀，Smart SpecTM3000型分光光度計(BIO-RAD)，VE-180型電泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300型電泳儀(上海天能科技有限公司)，TGL-16G 臺式離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。主要試劑：丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、硝酸銀、37%甲醛、四乙基乙二胺(TEMED)、ISSR引物(北京賽百盛基因技術有限公司)。

表1　試驗材料及來源

1.3　黨參基因組DNA的提取

取黨參試驗材料，采用經(jīng)改進的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取DNA[4-5]，用瓊脂糖凝膠電泳測定其純度，用分光光度計測定其濃度，將提取的DNA稀釋到終濃度 40 ng/μL，用作PCR擴增的模板。

1.4　ISSR引物的篩選和PCR擴增

選用提取的黨參基因組DNA為模板，進行ISSR引物篩選和PCR反應擴增。PCR反應體系為20 μL：模板DNA 1 μL(約30～53 ng)，ISSR引物1 μL(約5 pmol)，PCR mix 18 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取擴增產(chǎn)物5 μL 在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，以0.5×TBE為緩沖液，穩(wěn)壓150 V，電泳至溴酚藍距凝膠邊緣2～3 cm處結束。采用銀染法進行染色。

1.5　數(shù)據(jù)處理與分析

ISSR-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，得到電泳圖譜，用Quantity One 6. 0分析軟件結合人工讀帶，按條帶的有無(有記為1，沒有則記為0)記錄電泳條帶，同時將出現(xiàn)頻率超過99%的條帶視為共有帶，出現(xiàn)頻率低于1%的條帶，即被視為沒有條帶而不計入內(nèi)。將讀出的數(shù)據(jù)錄入Excel，建立數(shù)據(jù)庫矩陣。

應用NTsys 2.10e軟件，利用ISSR分子標記數(shù)據(jù)計算黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)，采用非加權組平均法(UPGMA)構建黨參品種間的遺傳關系聚類圖；將SM遺傳相似性矩陣進行Dcenter數(shù)據(jù)轉化，求其特征量和特征向量，生成主坐標二維、三維散點圖。

2　結果與分析

2.1　ISSR引物的篩選及擴增結果

以來自道真陽溪1號和2號黨參基因組DNA作為模板，從100條引物中篩選出10條引物。利用這10條引物能在12個黨參試驗材料中擴增出清晰的條帶，且多態(tài)性、穩(wěn)定性和重復性較好(表2)。

表2　引物篩選及擴增結果

2.2　ISSR-PCR圖譜及多態(tài)性分析

本研究從100條引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性好、多態(tài)性豐富的10條引物，對12份供試黨參樣品進行ISSR-PCR擴增，共擴增出136個可區(qū)分的DNA條帶，平均每條引物擴增出13.6條條帶(表2)。在擴增出的136條DNA條帶中，多態(tài)性條帶有114條，多態(tài)性條帶占比為83.82%，平均每條引物擴增11.4條多態(tài)性條帶。其中引物UBC807和UBC811擴增的條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)較為豐富(圖1)，DNA總條帶數(shù)分別為16條和19條，多態(tài)性條帶數(shù)分別為14條和16條。這表明川黨參種質(zhì)具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.3　遺傳相似性分析

利用ISSR分子標記數(shù)據(jù)計算黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)(表3)。ISSR-PCR擴增結果表明，12個黨參品種之間的遺傳相似性系數(shù)均在0.5以上，平均為0.683 6，處于 0.518～0.908之間。其中道真陽溪洛龍黨參品種(1)和四川樂山黨參品種(12)之間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.518，二者之間親緣關系最遠；四川樂山(12)和四川雅安(10)之間的遺傳相似性系數(shù)最大，表明二者之間的親緣關系最近。道真縣的3個洛龍黨參品種(1、2、3)之間的遺傳相似性系數(shù)均較大，在0.775以上，但道真洛龍黨參品種與四川地區(qū)的6個品種(7～12)之間的遺傳相似性系數(shù)較小，在0.50～0.65之間，表明遵義道真洛龍黨參品種與四川地區(qū)黨參品種的親緣關系較遠。

表3　遺傳相似性分析結果

2.4　聚類分析

基于遺傳圖距，應用NTsys 2.10e軟件，對來自道真洛龍、四川、重慶及湖北的12個黨參品種進行UPGMA聚類分析。如圖2所示，12個黨參品種在0.591處分為A、B 2支，來自遵義道真、重慶及湖北的6個黨參品種(1～6)聚為A支，來自四川省的6個黨參品種(7～12)聚為B支，而A支中來自道真洛龍和重慶奉節(jié)與巫山的黨參品種又聚為A1支，A1支又分為A11(道真3個品種)和A12(重慶2個品種)2支，來自湖北的黨參品種(6)單獨成1支(A2支)，來自四川的6個黨參品種分為B1和B22支，但遺傳差距很小。結果表明，本研究中的12個黨參種植品種與地理分布有著明顯的相關性，來自同一地區(qū)的品種間遺傳差異較小，而不同地區(qū)的品種之間的遺傳差異最大。

2.5　主坐標分析

主坐標分析以黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)矩陣為基礎，不同品種在主坐標圖中的位置能反映它們之間的親緣關系。品種間位置越接近，表明它們的遺傳相似性越大，親緣關系越近，反之，則表明遺傳差異越大，親緣關系越遠[6]。產(chǎn)生的主坐標二維、三維散點圖分別見圖3、圖4。不難看出，主坐標分析結果與聚類分析結果一致。來自道真洛龍的3個黨參品種(1～3)遺傳相似性較高，聚集在二維圖的右上角，來自重慶及湖北的3個黨參品種分布在二維圖的右下方；來自四川的6個黨參品種(7～12)遺傳距離較遠，分布在二維圖的左側，由于四川的6個黨參品種間的遺傳差異很小，因此密集地聚集在一起。從三維圖上更能看出品種間的分類很明顯。

3　結論與討論

DNA分子標記技術發(fā)展至今已有幾十種，ISSR分子標記技術由于具有成本低、可靠性及穩(wěn)定性高，試驗操作簡單、快速、高效等優(yōu)點，被廣泛應用到各類研究中，是理想的分子標記技術[7-8]。利用ISSR分子標記技術研究黨參遺傳多樣性的報道不多，陳大霞等用21條ISSR引物對18份川黨參材料擴增出223個DNA條帶，其中有166個多態(tài)性條帶，平均多態(tài)率為74.44%[9]；郭宏波從100條ISSR中篩選出13條引物，對來自山西和甘肅2省的150份黨參材料進行分析，擴增出127個清晰的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶122個，平均多態(tài)率為95.77%[10]。以上研究表明，ISSR分子標記技術具有良好的穩(wěn)定性和準確性，適合用于種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。

本研究選用洛龍黨參和四川、重慶、湖南各產(chǎn)地種植黨參品種，以黨參的幼苗為材料，對CTAB法進行優(yōu)化改良，提取黨參基因組DNA。通過優(yōu)化PCR反應體系，從100條不列顛哥倫比亞大學(UBC)公布的ISSR引物中篩選，以不同產(chǎn)地種植黨參的基因組DNA為模板，用篩選的ISSR引物進行分子標記PCR擴增，用聚丙烯酰胺電泳對產(chǎn)物進行檢測，有利于擴增產(chǎn)物的分辨。本次篩選出的10條ISSR引物對12個黨參品種共擴增出136個清晰的DNA條帶，多態(tài)性條帶114條，平均多態(tài)性比例為83.82%，最高為92.86%，最低為71.43%。其中引物UBC811擴增出的DNA條帶總數(shù)和多態(tài)性DNA條帶數(shù)最多，分別為19條和16條；而引物UBC835擴增的DNA條帶數(shù)最少，只有8條，多態(tài)性DNA條帶數(shù)6條。ISSR標記DNA圖譜表明，洛龍黨參與其他川黨參具有豐富的基因資源。基因型是遺傳和生態(tài)2個因素長期復雜的相互作用的產(chǎn)物，土壤和地理環(huán)境對種內(nèi)變異起重要作用[11]。黨參大面積的種植通常采用種子和種根2種繁殖方式[9]，零星種植也常采用野生種及半野生種的馴化栽培，因此黨參種源復雜，加上道真、四川、重慶及湖北等地不同土壤和地理環(huán)境以及氣候與光照的影響，造成了黨參品種具有豐富的遺傳多樣性。

遺傳相似性分析與基于遺傳距離的聚類分析及主坐標分析顯示，12個黨參品種遺傳距離與地理位置分布有著明顯的相關性。四川省的6個黨參品種遺傳距離較遠，形成1支，且品種間的遺傳距離很近，相似性高；道真洛龍黨參與重慶黨參品種遺傳相似性最高，與湖北黨參品種間的遺傳相似性次之，與四川省的黨參品種遺傳相似性最低。張建清等利用隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)技術分析甘肅栽培黨參的遺傳多樣性時，也發(fā)現(xiàn)黨參栽培居群的遺傳距離與地理分布呈現(xiàn)一定的相關性[12]，這可能與地域間基因的流動受限有關，也與大面積黨參種植采用種根繁殖有關， 影響了黨參種質(zhì)的遺傳多樣性。因此，建議在今后的黨參育種過程中，考慮開展不同優(yōu)良品種中種群間的雜交育種，以獲得更廣泛的遺傳基礎，培育出優(yōu)良的新品種。

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