用自擬的高效液相色譜法測定自制氨甲苯酸原料含量及有關物質的效果

王紫華

﹝上海現代哈森（商丘）藥業有限公司，河南 商丘 476000﹞

氨甲苯酸是臨床上常用的止血藥。用該藥進行止血的機制為：血液循環中存在各種纖溶酶（原）的天然拮抗物。氨甲苯酸可競爭性地阻滯纖溶酶原吸附在纖維蛋白網上，防止纖溶酶被激活、纖維蛋白被纖溶酶降解，從而發揮止血的作用[1]。現行的氨甲苯酸原料質量控制標準（用滴定分析法進行含量測定，用顏色控制終點）僅可對藥品中的總雜進行控制，且操作過程較為繁瑣、檢測結果的誤差較大[2]。有研究結果證實，用高效液相色譜法（HPLC法）測定氨甲苯酸原料含量的專屬性要優于用滴定分析法進行測定的結果。在本次研究中，筆者根據《中國藥典》（2010年版第二部）附錄XIXA 藥品質量標準分析方法驗證指導原則[3]，在參考現行的氨甲苯酸原料質量控制標準的基礎上，結合自制氨甲苯酸原料的合成工藝，用自擬的HPLC法測定氨甲苯酸原料的含量及有關物質，以期更好地控制該藥品的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（包含流動相瓶、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、G1314F VWD檢測器、Agilent chemStation 色譜工作站，由安捷倫公司生產）及CPA225D 電子分析天平（由賽多利斯公司生產）。

1.2 試藥

氨甲苯酸對照品（批號：100921-200701，純度：99.8%，購于中國藥品生物制品檢定所）、對氯甲基苯甲酸對照品（批號：20120421，純度：99.9%，自制）、對氰基氯芐（批號：20120311，純度：99.8%，由連云港三諾化工有限公司生產）、乙腈（為色譜純）、水（為超純水）、其他試劑（為分析純）、氨甲苯酸原料樣品（批號分別為S12052361、S12052461、S12052561，均為自制）。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液和對照品溶液的制備方法

精密稱取20 mg的氨甲苯酸原料樣品（批號：S12052361），向其中加入水，將其溶解、稀釋至50 ml。精密量取1 ml的該稀釋液，向其中加入流動相，將其稀釋至10 ml后混合均勻，將該溶液作為供試品溶液。精密稱取20 mg的氨甲苯酸對照品（批號：100921-200701），用與配制供試品溶液相同的方法配制對照品溶液。供試品溶液和對照品溶液的濃度均為40 μg/ml。

2.2 自擬HPLC的色譜條件與系統適用性試驗

2.2.1 色譜條件 色譜柱：氨基鍵合硅膠柱（Ultimate XBNH2，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈 -0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（比例為69：31，用磷酸將其pH調節為4.0），樣品的檢測波長：235 nm，流動相的流動速度：1.0 ml/min，樣品的進樣量：10 μl，色譜柱的溫度：30℃。

2.2.2 系統適用性試驗 精密稱取40 mg的氨甲苯酸對照品，向其中加入水，將其溶解、稀釋至10 ml。精密量取1 ml的該稀釋液，向其中加入流動相，將其稀釋至10 ml后搖勻。分別按自擬的色譜條件和現行的標準色譜條件進樣6次，結果顯示，在自擬的色譜條件下，氨甲苯酸對照品溶液的主峰保留時間較短（可節約檢測時間），且其峰對稱性較好、塔板數較大、系統適用性良好、分離度和重復性均較好，證實該色譜條件優于現行的標準色譜條件。

2.3 自擬HPLC的檢測限和定量限

取10.08 mg的氨甲苯酸對照品，將其置于50 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加水，將其溶解、稀釋至刻度，配制成100%溶液。取1 ml的該100%溶液，將其置于100 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動相至刻度，配制成1%溶液。取1 ml的該1%溶液，將其置于100 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動相至刻度，配制成0.01%溶液。取3 ml的該0.01%溶液，將其置入20 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動相至刻度，即得到氨甲苯酸檢測限溶液的濃度（0.003204 μg/ml）。另取1 ml上述的1%溶液，將其置入10 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動相至刻度，配制成0.1%溶液。取1 ml的該0.1%溶液，將其置于20 ml的容量瓶中，向該容量瓶中加入流動相至刻度，即得到氨甲苯酸定量限溶液的濃度（0.01008 μg/ml）。分別精密量取10 μl的氨甲苯酸檢測限溶液和定量限溶液，將這兩種溶液注入液相色譜儀。在色譜儀的信噪比約為3時，得到氨甲苯酸的最低檢出量。經計算，該最低檢出量為0.03204 ng。在色譜儀的信噪比約為10時，得到氨甲苯酸的定量限。經計算，該定量限為0.1008 ng 。

2.4 自擬HPLC的線性范圍

精密稱取50 mg的氨甲苯酸對照品，向其中加水，將其溶解、稀釋至50 ml后混勻。精密量取7份上述的稀釋液，用流動相將其分別稀釋成濃度為500 μg/ml、400 μg/ml、200 μg/ml、40 μg/ml、20 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml的溶液。按擬定的色譜條件，分別精密量取10 μl上述不同濃度的溶液進行檢測，檢測時的峰面積分別為23370.60、18855.00、9468.74、1917.07、956.20、190.74、94.94。以這7份樣品的濃度為橫坐標，以其峰面積為縱坐標作圖，得出方程：y=46862x+30.378，r=1。結果表明，在擬定的色譜條件下，當氨甲苯酸對照品的進樣量在2～500μg/ml范圍內時，峰面積與樣品濃度的線性關系良好，符合藥典規定的分析方法驗證要求。

2.5 自擬HPLC的精密度（重復性）試驗

《中國藥典》（2010年版第二部）規定：精密度是指在規定的測試條件下，對同一個均勻供試品進行多次測定后所得結果之間的接近程度。一般用相對標準偏差（RSD）對精密度進行考察（RSD≤1.0%）。取氨甲苯酸原料樣品（批號：S12052361），將其分別配制成6份供試品溶液。用自擬的HPLC對這6份供試品溶液進行檢測的結果顯示，其含量分別為100.18%、99.99%、99.78%、99.83%、99.74%、99.70%，其含量的平均值為99.87%，其含量的RSD為0.2%。這一檢測結果表明，該檢測方法的精密度良好。

3 對氨甲苯酸原料樣品中有關物質的檢測

精密稱取40 mg的氨甲苯酸原料樣品（批號：S12052361），向其中加入水，將其溶解、稀釋至10 ml。精密量取1 ml的該稀釋液，向其中加入流動相，將其稀釋至10 ml，制成供試品溶液。精密量取1 ml的供試品溶液，向其中加入流動相，將其稀釋至100 ml，制成對照溶液。用自擬的HPLC檢測3批（批號分別為S12052361、S12052461、S12052561，均為自制）氨甲苯酸原料樣品的最大單雜和總雜（要求：最大單雜≤0.1%，最大總雜≤0.5%），結果顯示，其單雜分別為0.028%、0.021%、0.020%，其總雜分別為0.042%、0.038%、0.033%。用現行的滴定分析法對這3批氨甲苯酸原料樣品進行總雜（要求：最大總雜≤1.0%）檢測的結果分別為0.030%、0.021%、0.020%。

4 對氨甲苯酸原料樣品含量的測定

按“2.1”中使用的供試品溶液和對照品溶液的制備方法重新配制供試品溶液和對照品溶液，用自擬的HPLC法對新制備的供試品溶液和對照品溶液進行檢測，按外標法計算其峰面積，結果顯示，這3批氨甲苯酸原料樣品的含量分別為99.61%、99.66%、99.58%。用現行的滴定分析法對這3批氨甲苯酸原料樣品進行含量檢測（要求：含量≥98.0%）的結果分別為99.86%、99.86%、99.85%。

5 討論

5.1 用自擬的HPLC檢測氨甲苯酸原料波長的選擇依據

對氨甲苯酸溶液進行紫外掃描的結果顯示，其在235 nm波長處有最大吸收。合成工藝的起始原料對氰基氯芐、中間體對氯甲基苯甲酸、氨甲苯酸自身的降解雜質在該波長處均能與主藥進行良好的分離，且能被有效地檢測，故選擇235 nm作為用自擬的HPLC檢測氨甲苯酸原料的波長。

5.2 用自擬的HPLC檢測氨甲苯酸原料流動相的選擇依據

在本次研究中，筆者將自擬HPLC的流動相﹝乙腈-0.025 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（比例為69：31，用磷酸將其pH調節為4.0）﹞與現行滴定分析法的流動相﹝乙腈-水溶液（比例為3：1，在200 ml的水中加入1滴冰醋酸，再加入4.0%的氫氧化鈉溶液，將其pH調節至7.4）﹞進行了對比，結果顯示，自擬HPLC的流動相其主峰保留的時間較短，其適用性較好，故將其作為檢測氨甲苯酸原料的流動相。

[1]氨甲苯酸注射液說明書湖南洞庭藥業股份有限公司[Z]. 2007.2.

[2]《中華人民共和國藥典》1995年版.二部[S].1995:737-738.

[3]《中華人民共和國藥典》2010年版.二部[S].2010:194-195.