羊布魯氏菌病實驗室常用檢測方法對比試驗

阿力米古麗·烏米爾哈孜

（新疆塔城地區動物疾病控制與診斷中心，塔城 834700）

0 引言

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌感染引起的一種急慢性人畜共患病。除感染羊和人類外，還可危害牛、豬等動物。該種致病菌對妊娠動物造成的危害嚴重，其他動物感染該種致病菌后不會表現出明顯的臨床癥狀，很難在較短時間內作出診斷，很難及時對病情做出診斷，當出現典型臨床癥狀后，表示病情已經嚴重傳播流行。由于布魯氏桿菌病屬于國家二類動物傳染性疫病，同時也是一種人畜共患病，確診后，在做好患病羊撲殺處理同時，還應做好羊群凈化處理。而在對患病羊進行診斷和羊群凈化處理過程中，通常選擇使用虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗進行針對性診斷，逐步凈化羊群，培育無病羊群。為進一步探討上述2種實驗室檢測方法的準確性，研究主要在3個規模化羊養殖場分3個批次采集了3 000份新鮮血液，進行血清學檢查，對比2種檢測方法的準確率和靈敏度。

1 試驗材料與方法

1.1 材料選取

羊血清主要采自于新疆塔城地區3個規模化養殖場，共分3個批次進行集中采集，共采集3 000份，將采集到的新鮮血液帶回實驗室，常規方法分離得到血清，-20 ℃低溫保存。研究選擇的虎紅平板凝集試驗抗原和陽性血清、試管凝集試驗抗原和陽性血清，均來自于青島易邦生物工程有限公司，生產批號分別為獸藥字（2011）150138017和（2011）150138011。

1.2 方法

首先，血液采集和血清制備。分3個批次在新疆塔城地區3個規模化養殖場采集羊的新鮮血液。采集時，先將羊保定，將靜脈表皮的羊毛消毒剔除后，采集靜脈新鮮血液。血液采樣后，用標記筆在采血器上注明對應的羊耳標號，除去針頭后放置在保溫箱內保存，及時送回實驗室進行離心處理，得到上層血清，血清制備完成后，放置于-20 ℃的冰箱內保存[1]；其次，虎紅平板凝集試驗。虎紅平板凝集試驗操作應嚴格按照中華人民共和國相關標準進行，使用標記筆，在滅菌干凈的玻璃板上編號，用移液器吸取30 μL虎紅平板凝集抗原，然后分別吸取采集到的血清30 μL，與虎紅平板凝集抗原混合均勻，同時設置陽性對照組，如果待檢血清出現顆粒或絮狀物凝集判定為陽性，完全不凝集判定為陰性[2]；再次，試管凝集試驗。試管凝集試驗操作也需要嚴格按照國家相關標準進行，對試管標記，向第1個標記好的試管內添加1.15 mL的稀釋液，剩余的試管中可添加0.5 mL的稀釋液，使用移液器，在第1個試管中加入待檢血清0.1 mL，用移液器連續吹打5～6次，混合均勻后，吸取0.25 mL混合液舍去，再吸取0.5 mL混合液，加入到第2個試管，按照上述方法混合均勻，再吸入第3個試管，混合液0.5 mL，依次稀釋到第4個試管。確保試管稀釋度分別為1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100，然后再向試管中添加20倍稀釋的抗原稀釋液，每個試管中添加0.5 mL，充分震蕩混合均勻，確保血清稀釋度控制在1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。同時設置陰性對照組、陽性對照組、抗原對照組，并配制比濁管振搖均勻。將全部的試管放置在37 ℃保溫箱內，持續培養24 h，取出試管后記錄檢查結果，以比濁管為標準進行判定，對比上層液體的清亮程度。“4+”表示完全凝集，全部下沉，上層液體100%清澈；“3+”表示幾乎凝集，上層液體100%清澈；“2+”表示顯著凝集，上層液體50%清澈；“+”表示有沉淀，上層液體25%清澈；“-”表示無沉淀，液體均勻陰性[3]；最后，靈敏度對比試驗。為有效檢測上述2種方法的靈敏度，將虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測為陽性的血清分別進行虎紅平板凝集和試管凝集交叉試驗，驗證第1次檢測出陽性血清的2種方法的準確度。

2 結果

2.1 虎紅平板凝集與試管凝集試驗檢測對比

通過使用虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗，對3 000份血清分別進行檢測，其中第1個批次的513份羊血清中虎紅平板凝集試驗檢測出13份，試管凝集試驗共檢出陽性血清12份，檢出率分別為2.53%、2.34%。第2批1 269份羊血清中虎紅平板凝集試驗檢測出16份，試管凝集試驗共檢出陽性血清17份，檢出率分別為1.26%、1.34%。第3批1 218份羊血清中虎紅平板凝集試驗檢測出14份，試管凝集試驗共檢出陽性血清16份，檢出率分別為1.15%、1.31%，見表1。

表1 虎紅平板凝集試驗與虎紅平板凝集試驗檢測對比

2.2 虎紅平板凝集與試管凝集試驗靈敏度對比

將第1次檢測為陽性的血清分別進行其他2種檢測方法再次檢測，檢測結果顯示，第1次虎紅平板凝集試驗檢測出來的50份陽性血清，試管凝集試驗檢測45份全部為陽性，有5份為陰性。試管凝集試驗檢測出來的45份陽性血清中經虎紅平板凝集試驗檢測，45份全部呈陽性。由此可知2種檢測方法以試管凝集試驗檢測靈敏度和準確度更高，虎紅平板凝集試驗檢測過程中可能存在假陽性。

3 結束語

羊布魯氏桿菌病檢測過中應用較為常見的檢測方法主要為虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗2種。通過本次檢測結果可知，虎紅平板凝集試驗的檢出率高于試管凝集試驗，總體檢出率分別為1.67%和1.50%。為進一步驗證2種檢測方法的靈敏度，將上述2種方法第1次檢測出來的陽性血清分別再進行交叉檢測。檢測結果顯示，虎紅平板凝集試驗檢測出來的50份陽性血清中，有45份陽性，5份陰性。試管凝集試驗檢測出來的45份血清中應用虎紅平板凝集試驗再次檢測，全部為陽性，由此可知虎紅平板凝集試驗檢測存在假陽性，其靈敏度相對于試管凝集試驗較低。但由于該種檢測方法具有較強的特異性，因此可以將其作為初步羊布魯氏桿菌陽性血清篩選檢測和流行病學調查，然后將篩選出來的陽性血清進行試管凝集排除假陽血清，將2種方法有效結合，實現優勢互補。

在今后羊布魯氏桿菌檢測時應結合實際情況，選擇合適的檢測手段，將虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗有效結合，極大提高防控質量，提高檢測準確率，減少疾病傳播蔓延。