不同固定液對冷凍組織病理切片HE染色質量對照研究

余燕琪，邊慶華

快速病理診斷中，冷凍切片發揮著十分重要的作用，冷凍切片的質量能夠直接影響到診斷的快速性和準確性。但是干擾冷凍切片質量的因素較多，其中一項最重要的因素就是冷凍切片的固定液選擇，其對冷凍切片的HE染色質量有著十分重要的影響[1]。因此為了選擇出最佳的固定液，本次研究針對52例冷凍組織病理切片分別采用了4種不同的固定液進行固定，并對所有切片進行HE染色，查看其染色效果。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇本院2016年臨床科室術中送檢的52例新鮮組織參與研究，其中共有36例惡性病變組織，16例良性病變組織，組織來源主要包括甲狀腺、乳腺和肺。

1.2方法將新鮮的組織制成切片，切片制作使用的儀器為德國Leica CM1950恒冷切片機。隨后準備好實驗需要使用的4種固定液，分別是丙酮、95%乙醇、AAF液和改良AAF液。其中AAF液是由15 m1 40%甲醛、80 m1 95%乙醇和5 m1冰醋酸構成，改良AAF液則是由15 m1福爾馬林、40 m1 95%乙醇、42 m1苦味酸飽和95%乙醇液、3 m1冰醋酸、0.2 m1 Triton構成。

使用OCT冷凍包埋劑將新鮮的組織塊進行包埋，隨后放入冷凍切片機，確保組被冷凍至合適的硬度，隨后進行組織切片處理，切片厚度為4μm，每個標本需要進行4次切片，以形成4張切片，隨后將切片放入4種不同的固定液中，并對切片進行HE染色，染色完成后將切片放置顯微鏡下進行觀察。

2　結果

采用丙酮固定液進行固定的切片，在顯微鏡下表現出不清晰的組織結構，細胞核存在明顯的收縮現象，細胞核和細胞質的染色效果較差，著色不鮮艷；采用95%乙醇固定液進行固定的切片，在顯微鏡下能夠看見較清晰的組織結構，細胞核存在收縮現象，細胞核染色模糊，細胞質染色效果不佳，著色不鮮艷；采用AFF液進行固定的切片，在顯微鏡下可以看到較為清晰的組織結構，但是細胞核輪廓顯示不清晰，細胞核的染色效果較佳，但細胞質染色效果不佳，著色不鮮艷；采用改良AFF液進行固定的切片，在顯微鏡下可以看到清晰的組織結構，細胞核和細胞質染色效果清晰，顏色鮮艷，兩者對比效果明顯，見表1。

表1　不同固定液對染色質量的影響比較

3　討論

冷凍切片是一種快速制片技術，在外科手術和病理科中較為常見，它將病理組織冷凍至一定硬度后再進行切片處理[2]。在外科手術中，借助冷凍切片能夠對腫瘤性質和手術切緣進行快速、準確的評估，從而幫助醫師快速選擇合理的手術方式。因此冷凍切片的質量對病理診斷的準確性和快速性有著決定性的作用。甲狀腺、乳腺和肺是最常見的冷凍組織病理切片送檢標本，其中甲狀腺切片容易出現收縮的現象，細胞核內容易出現白色空泡，從而導致空泡和核內包涵體出現混淆的情況；同時成片腫瘤細胞的細胞質顏色較淡，因此組織結構表現不清晰，觀察時容易將其誤認成毛玻璃核，在進行HE染色時，若染色較淡，則會難以辨認出乳頭軸心，并且對其的冷凍溫度應控制在合理范圍內，不得過低[3]。肺組織具有豐富的血供和腔隙，可能會存在大量壞死或炎性分泌物的情況，因此在進行冷凍時注意控制冷凍時間，否則可能會出現假象。乳腺組織在制成冷凍切片時，需要保證沒有重疊褶皺現象，并確保切片不存在裂隙，使切片保持良好的對比度，并使組織界限能夠清晰地展露出來，不得對細胞核過度染色或深層染色[4]。對于導管內乳頭狀病變組織而言，一般會同時存在大汗腺化生的現象，因此在冷凍切片中，細胞核存在收縮現象，同時伴有深染現象，細胞質的HE染色效果較差，從而對診斷結果產生不利影響。另外，肥胖或乳腺萎縮可能會導致細胞間質中存在較多的脂肪，在此情況下可以適量降低冷凍的溫度，從而使切片保持完整，避免出現褶皺或者重疊的現象[5]。

進行組織固定的目的是將組織蛋白質進行變性和凝固，使其沉淀，從而使組織和細胞能夠保持原本的形態。冷凍切片質量好壞的重要影響因素之一是切片固定，如果切片固定效果較差，則再進行HE染色時無法得到預期的染色結果[6]。因此本次研究針對冷凍組織病理切片采用了4種不同的固定液進行固定，并對染色質量進行分析對比。其中丙酮和乙醇都是單純性的固定劑，丙酮具有很強的滲透力，能夠使蛋白質完全沉淀，但是對細胞核沒有很好的固定效果，著色效果較差，并且使用丙酮后細胞核收縮明顯，容易產生脫片情況；乙醇能夠將切片上的水分去除，從而使切片的組織結構得以完好的保存下來，并且能夠使球蛋白、白蛋白、核蛋白完整沉淀，但是核蛋白的沉淀會在水中溶解，從而使得著色效果不佳，除此之外，乙醇還會形成一層蛋白膜覆蓋在組織表面，從而使固定液和染液不能很好地滲入，從而對染色質量產生不良影響[7]。單純性固定液在進行固定時不可避免存在一定的局限性，通過一定的比例混合后形成復合型固定液，則可以取長補短，提高固定的質量和效果。AFF液和改良AAF液是復合型固定液，AFF液主要是由乙醇、甲醛和冰醋酸構成，冰醋酸具有很強的穿透作用，能夠在較短時間內完成組織的固定工作，甲醛不會使組織產生收縮反應，固定效果均勻，但是不能使核蛋白沉淀，通過與乙醇的配合可以有效地進行脫水和協同固定，雖然乙醇對組織細胞具有一定的收縮作用，但是因冷凍產生的細胞內液體膨脹和冰醋酸導致的組織膨脹現象不完全借助乙醇來抑制，因此細胞核易出現腫脹現象，從而使細胞核的染色效果不良[8]。因此在此基礎上對AAF液進行了改良工作，加入了苦味酸飽和95%乙醇液和Triton，苦味酸作為一種酸性固定劑，能夠對一切蛋白質產生沉淀作用，并且具有明顯的收縮效果。苦味酸飽和乙醇具有很強的組織收縮性，能夠有效緩解組織膨脹的現象，從而使組織和細胞能夠保持原有的形態，也能實現對標本的脫水。Triton X-100是一種離子表面活性劑，能夠在短時間內脫去組織和細胞膜中的脂質，從而使細胞膜的通透性得到有效改善，方便固定液能夠在短時間內深入細胞質和細胞核，從而提高染色的質量。此次研究中，復合型固定液固定切片的染色效果明顯優于單純性固定液，以改良AAF液的固定效果最佳。

綜上所述，固定液的選擇對于冷凍切片的染色效果有直接影響，采用改良AAF固定液能夠有效地實現對冷凍組織病理切片的固定，能夠有效提升染色質量，得到準確的效果，因此值得臨床推廣。

[1]王曉宇,齊君,孟憲杰,等.不同固定液對冷凍組織病理切片HE染色質量比較[J].中國法醫學雜志,2016,31(2):165-167.

[2]周君,謝明,彭茜茜,等.4種固定液對快速冷凍切片的制片效果的影響[J].中國醫學工程,2016,24(9):32-33.

[3]馮家成,楊靜,張柏輝,等.三種不同固定液和固定方法對腦組織冷凍切片的影響[J].臨床與實驗病理學雜志,2015,31(5):593-594.

[4]王俊生.探討HE染色方法在臨床病理診斷中的應用價值[J].世界最新醫學信息文摘,2016,16(68):144,149.

[5]吳平,張聲.無醛固定液與甲醛固定液對組織形態學保存效果比較[J].臨床與實驗病理學雜志,2015,31(3):343-345.

[6]王曉宇,齊君,孟憲杰,等.不同固定液對冷凍組織病理切片HE染色質量比較[J].中國法醫學雜志,2016,31(2):165-167.

[7]董蕓蓉.不同固定液對甲狀腺冷凍切片固定效果的比較[J].臨床與實驗病理學雜志,2016,32(6):710-711.

[8]余鑫鑫,袁靜萍,閻紅琳,等.4種固定液對甲狀腺冷凍切片固定效果的比較[J].診斷病理學雜志,2016,23(8):630-631.