結腸癌組織中Notch1、NF-κB、uPA及p-Akt的表達變化及意義

趙雪,高玉彤

(天津醫科大學，天津300070)

結直腸癌是世界范圍內的常見惡性腫瘤，同時亦是預后較差的惡性腫瘤之一，在全球腫瘤死亡原因中位居第二位，是癌癥相關死亡的第五大常見原因[1,2]。近年來，我國結直腸癌的發病率呈不斷上升趨勢。盡管結直腸鏡的廣泛使用使得部分早期腫瘤患者獲得較好的預后，但對于多數中晚期結直腸癌患者而言，預后并未明顯改善。最近有研究表明，Notch信號通路及PI3K-AKt信號通路的過度活化會激活其共同的下游信號分子核因子κB(NF-κB)，從而參與多種腫瘤的發生發展[3，4]。尿激酶介導的纖溶酶原激活物(uPA)是一種絲氨酸蛋白酶，能催化無活性的纖溶酶原轉化為有活性的纖溶酶，降解基底膜和細胞外基質中的蛋白質，從而參與癌癥的侵襲和轉移，但uPA與結直腸癌的相關研究甚少。2017年3～9月，我們應用免疫組化SP法檢測Notch1、NF-κB、uPA 和p-Akt在結直腸癌、結直腸腺瘤和正常黏膜組織中的表達，探討這些指標在結直腸癌發生發展中的作用及可能臨床應用價值。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2010年1月～2016年9月存檔于天津醫科大學總醫院病理科的結腸癌手術標本86例，其中患者男37例、女49例；年齡40～91歲，中位年齡71.5歲；有淋巴結轉移41例，無淋巴結轉移45例；Dukes分期：A+B期30例，C+D期56例；侵出漿膜者49例，未侵出漿膜者37例；組織學分級：高分化腺癌33例，中分化腺癌39例，低分化腺癌14例；結腸腺瘤手術標本25例，其中患者男11例、女14例，年齡49～77歲，中位年齡61歲。選取相應結腸切緣(距離癌組織>50 mm)正常黏膜30例作為對照。每例標本的病理均經資深病理醫師重新復核，確保診斷的正確性。

1.2Notch1、NF-κB、uPA 、p-Akt表達檢測采用免疫組化PV兩步法。小鼠抗人Notch1單克隆抗體(濃縮型)、兔抗人NF-κB多克隆抗體(濃縮型)、兔抗人p-Akt單克隆抗體(濃縮型)購自北京中山金橋生物技術有限公司，兔抗人uPA多克隆抗體(濃縮型)購自武漢博士德生物技術有限公司；PV-6000 通用型兩步法免疫組化檢測試劑盒及 DAB 顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。實驗用蠟塊均做4 μm厚的連續切片，將切片附于載玻片上，置于66～70 ℃的烤箱中烤蠟1.5～2 h，常規脫蠟至水，參照PV-6000通用型兩步法免疫組織化學染色說明書進行實驗操作，每組實驗均設空白對照，以PBS代替一抗 。 Notch1抗體稀釋濃度為1∶250，細胞定位：細胞質和細胞膜；NF-κB抗體稀釋濃度為1∶250，細胞定位：細胞質；uPA抗體稀釋濃度為1∶300，細胞定位：細胞質，這三種抗體的修復方法為PBS磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)，微波爐，3 min×2次。p-Akt抗體稀釋濃度為1∶100，細胞定位：細胞質或細胞核，修復方法為Tris/EDTA修復液(pH 8.0)，微波爐，3 min×2次。參照文獻[5～7]對結果進行判定：每例切片選取 5 個具有代表性的高倍(×400倍)視野，計數1 000個腫瘤細胞中陽性細胞的百分比，同時評估陽性信號的染色強度。計分和強度判定標準：陽性細胞數百分比≤10%計1分、11%～50%計2分、51%～75%計3分、>75%計4分；無特異性著色計0分、淺棕色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分;將陽性細胞百分比得分與染色強度得分相乘結果作為評價標準：0～1分計陰性(-)；2～3分為弱陽性(+)；4～6分為陽性(++)；7～12分為強陽性(+++),+～+++均為陽性表達。

1.3統計學方法采用SPSS21.0統計軟件。免疫組化染色結果分析采用χ2檢驗；各指標間的相關性分析采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1結腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織中Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt表達比較Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt在正常結腸黏膜、結腸腺瘤、結腸癌組織中表達率均呈遞增趨勢。Notch1在正常腸黏膜、腺瘤和結腸癌組織中的陽性率依次為36.67%(11/30)、36.00%(9/25)、65.12%(56/86)。Notch1在結腸癌中的表達率高于腺瘤和正常腸黏膜，差異有統計學意義(P均<0.05);Notch1在正常腸黏膜和腺瘤中的表達無統計學差異(P=0.959)。NF-κB在正常腸黏膜、腺瘤和結腸癌組織中的陽性率依次為30.00%(9/30)、32.00%(8/25)、63.95%(55/86)。NF-κB在結腸癌中的表達高于腺瘤和正常腸黏膜，差異有統計學意義(P均<0.05);NF-κB 在正常腸黏膜和腺瘤中的表達無統計學差異(P=0.873)。uPA在正常腸黏膜、腺瘤和結腸癌組織中的陽性率依次為23.33%(7/30)、40.00%(10/25)、70.93%(61/86)，uPA在結腸癌中的表達率高于腺瘤和正常腸黏膜，差異有統計學意義(P均<0.05)；uPA在正常腸黏膜和腺瘤中的表達無統計學差異(P=0.183);p-Akt在正常腸黏膜、腺瘤和結腸癌組織中的陽性率依次為23.33%(7/30)、36.00%(9/25)、59.30%(51/86)，p-Akt在結腸癌中的表達率高于腺瘤和正常腸黏膜(P均<0.05)；p-Akt在正常腸黏膜和腺瘤中的表達無統計學差異(P=0.303)。

2.2Notch1、NF-κB、uPA 和p-Akt表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt在結腸癌組織中的表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度和Duke's分期相關(P均<0.05)；與患者的年齡、性別無關(P均>0.05)，見表1。

表1　Notch1、NF-κB、uPA 和p-Akt表達與結腸癌患者臨床病理特征的關系(例)

2.3相關性分析結腸癌組織中Notch1和p-Akt、Notch1和NF-κB、NF-κB和uPA及p-Akt和NF-κB陽性表達均呈正相關關系(r分別為0.225、0.434、0.751、0.683，P均<0.05)。

3　討論

近年來，基于癌癥的發病率不斷上升而進行的大量的研究發現，各種信號通路的異常在癌癥的發生發展中起重要作用。目前已明確結腸癌是一種多步驟多基因參與的復雜過程[8]，其中涉及多種信號通路之間的相互聯系，在諸多信號通路中，Notch信號通路成為目前結腸癌研究領域的熱點。

Notch家族基因編碼一類高度保守的細胞表面受體，這些受體構成的信號通路影響細胞正常形態發生的多個過程，包括細胞自我更新、細胞分裂和細胞凋亡等[9]。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)、CSL DNA結合蛋白、其他效應物和Notch調節分子等組成。通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用而引起Notch通路的激活。哺乳動物細胞具有四個Notch受體(Notch1，2，3和4)，五個Notch配體(DLL1,3,4和Jagged 1,2)[10]。在多發性骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、皮膚癌和腦癌的研究中已經發現，Notch信號通路存在異常表達和激活途徑，其中Notch信號通路的4種受體中Notch1研究最為廣泛[11]。有文獻報道，Notch信號通路在腸發育和腸上皮更新的諸多方面參與調節，并且發現Notch1信號通路的異常激活與結腸癌的發生發展有關，在結腸腺癌中已經檢測到有Notch1異常表達[6]。本組實驗也證實了以上研究成果，顯示Notch1分子在結腸癌中的表達明顯高于結腸腺瘤的和正常黏膜組織(P<0.05)，但研究顯示這一差異在結腸腺瘤和正常黏膜組織中不具有統計學意義，提示我們Notch1的過表達在結腸癌發生過程的后期發揮作用。

研究顯示PI3K/Akt信號通路的異常激活既會導致細胞的惡性轉化，同時也會增加癌細胞侵襲轉移的能力，在多種腫瘤的發生發展中起重要作用。Akt即蛋白激酶 B (PKB)，是PI3K/Akt信號通路中的關鍵分子。磷酸化的p-Akt是其活化形式，Akt蛋白若未被磷酸化則不具有生物活性。經PI3K/Akt信號通路，Akt被磷酸化，生成磷酸化p-Akt而活化。Akt激酶家族由Akt1、Akt2和Akt3成員組成。研究發現，Akt在多種癌癥中存在過度表達問題，其中包括結腸癌、胰腺癌、卵巢癌和部分類固醇激素不敏感性乳腺癌[12]。本研究結果發現，本組病例由正常結腸黏膜組織到結腸腺瘤到結腸癌，p-Akt表達率逐漸增高，且統計分析顯示結腸癌中p-Akt表達高于結腸腺瘤及正常黏膜組織，差異有統計學意義。與Notch1相同，p-Akt表達在結腸腺瘤和正常黏膜組織中差異無統計學意義，提示p-Akt過表達在結腸癌發生的后期發揮作用。

AKT分子的激活途徑位于Notch信號通路的下游，通過AKT分子的活化將Notch信號通路與PI3K/Akt信號通路聯系起來，共同參與疾病的發生過程。本研究結果發現，在結腸癌的發生過程中，Notch1和p-Akt的表達呈正相關，提示這兩個信號系統的相互作用對結腸癌的發生發展有一定作用，此結果相關文獻報道較少，是目前腫瘤研究的一個熱點。

NF-κB是高度調節的二聚體轉錄因子家族集合名稱。研究表明，NF-κB參與多種生理病理過程，包括細胞生存、細胞黏附、炎癥、分化和生長[13]。哺乳動物細胞中NF-κB包括5個亞單位：Rel(cRel)、p65(RelA,NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)，它們被組裝成同源二聚體或異源二聚體而行使生物學功能，最常見是p65/p50異源二聚體[14]。NF-κB的持續異常激活在諸多腫瘤研究中已見報道，且涉及腫瘤發生的各個階段，如胰腺癌、乳腺癌和胃癌。NF-κB被認為是腫瘤發生和進展的癌基因[14]。本組實驗顯示NF-κB在結腸癌中存在過度激活，其在癌組織中的表達高于結腸腺瘤和正常結腸黏膜組織，差異有統計學意義，但研究未顯示這一差異存在結腸腺瘤和正常結腸黏膜組織中，提示NF-κB過表達在結腸癌發生的后期發揮作用。

Notch信號通路中，NF-κB是其下游信號的關鍵分子，Notch信號通路與NF-κB的相互作用及之間的多重交互機制在癌癥發生發展中發揮重要作用。迄今為止，只有Notch1 被報道與NF-κB間的相互聯系。本實驗發現Notch1和NF-κB表達呈正相關，提示二者的相互作用參與結腸癌的發生發展。

uPA系統參與諸多生理和病理事件，包括細胞遷移和組織重塑，如胚胎發生、排卵、炎癥、傷口愈合、血管生成和腫瘤侵襲和轉移。uPA是一種絲氨酸蛋白酶，在腫瘤研究領域發現其參與癌癥侵襲和轉移[15]。纖維蛋白溶酶原激活物在腫瘤浸潤和轉移中的作用主要通過癌細胞釋放纖維蛋白溶酶原激活劑活化纖溶酶原形成纖溶酶，從而催化蛋白質水解發揮作用。在本研究中，uPA在正常結腸黏膜組織中的表達率低于結腸腺瘤、結腸癌組織中，差異有統計學意義，表明uPA蛋白的高表達在結腸癌發生發展中起到一定作用。同樣，未發現在正常腸黏膜組織和腺瘤之間的表達存在統計學差異，表明uPA過表達主要與腫瘤細胞的侵襲相關。

本研究結果證實結直腸癌的發生是多基因參與過程，在不同階段，發揮作用基因及信號通路不同；不同信號通路間存在相互關聯。Notch1、NF-κB、uPA和p-Akt均參與結直腸癌的發生過程，但主要發生于由腺瘤轉換為腺癌的后期；通過Pearson相關分析發現，Notch1與NF-κB、NF-κB與uPA、p-Akt與NF-κB及Notch1與p-Akt表達均呈正相關關系，表明不同的信號通路間可通過關鍵分子聯系起來，協同發揮作用，導致腫瘤發生。這四項指標在結腸癌組織中的表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度、Dukes分期有關，此結果與相關文獻[3，4]報道一致，為結腸癌的預后判斷提供了新的標記物。

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