內質網自噬在Cajal間質細胞內質網應激損傷中的作用

張麗敏，凌江紅，2，周洲，徐寬，張鈺琴，謝天一，王煜姣

(1 廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021；2上海健康醫學院附屬周浦醫院)

Cajal間質細胞(ICCs)是胃腸活動的起搏者和調節者，對胃腸運動的調節起重要作用[1]。在人類[2]或動物[3]中，ICCs的數量減少或缺失、細胞網絡結構異常等應激損傷是導致該細胞活性減弱或消失，進而引發胃腸動力障礙的主要原因。因此，減輕ICCs的應激損傷，維持其細胞存活是一種有效促進胃腸動力的方法。內質網(ER)是調控細胞功能和維持細胞存活的重要細胞器之一，眾多因素可引起內質網穩態的改變，使內質網功能缺陷或喪失，引發內質網應激(ERS)。RES可導致細胞損傷，為避免損傷，細胞將通過激活自噬的一個新分支，選擇性地降解受損內質網以維持細胞內穩態。此自噬新分支由Bernales等[4]首先提出，稱其為內質網自噬。自噬具有雙向調節作用[5]，因此，抑制或激活內質網自噬成為潛在防治疾病的新靶點。但內質網自噬在ICCs的ERS損傷中的作用尚未明確。本研究旨在探討ERS引起ICCs損傷過程中內質網自噬的發生及其作用，為改善胃腸動力障礙提供新的靶標。

1　材料與方法

1.1材料實驗動物：SPF級SD大鼠，鼠齡8周，體質量(150±10)g，雌雄不限，購自廣西醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK 桂 2015-0003。適應性喂養于室溫25 ℃、光照周期12 h/12 h的環境中1周，自由進食、進水。實驗前禁食不禁水8 h。主要試劑和儀器：胎牛血清(Gibco, USA)，M199培養基(Hyclone, USA)，Ⅱ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA、大鼠干細胞因子SCF、三甲基腺嘌呤3-MA、雷帕霉素(Rapa,Sigma)，CD117/c-kit山羊抗大鼠多克隆抗體(Pierce)，異硫氰酸熒光素(FITC)-山羊抗兔多克隆抗體(Life)，逆轉錄試劑盒(Thermo Fisher)，qPCR試劑盒(Qiagen)，CCK-8試劑盒(Dojindo)，衣霉素(TM)、Ficoll400、4%多聚甲醛溶液、抗熒光淬滅封片液(Solarbio)，青霉素-鏈霉素溶液、兩性霉素B、PBS溶液(Genom, China)，水合氯醛、戊二醛(Kelong)。醫用超凈工作臺(Airtech)，CO2培養箱(Thermo Forma)，高速冷凍離心機(Eppendorf)，解剖顯微鏡(Luxikj)，倒置相差顯微鏡、正置熒光顯微鏡(Olympus)，實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，酶標儀(Multiskan Ascent)。

1.2ICCs的分離和培養參考文獻[6, 7],采用酶解法分離大鼠胃竇ICCs。取SD大鼠3只/次，雌雄不限，禁食不禁水8 h。10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，25%戊二醛術前消毒。開腹取胃，沿胃小彎剪開，取長約3 cm胃竇，用4 ℃預冷的PBS溶液(含1%青霉素-鏈霉素溶液)清洗3次。在解剖顯微鏡下用銳性鑷子剝離黏膜層及黏膜下層，取胃肌條剪碎成1 mm×1 mm大小，加入Ⅱ型膠原酶消化液(M199培養基配置，終濃度1.3 mg/mL)。置于37 ℃恒溫水浴箱消化組織碎塊45～50 min，1 300 r/min離心1.5 min,棄上清，PBS溶液重懸，再次離心棄上清后加入M199培養基。緩慢吹打15 min重懸，過200目篩網，收集于離心管內，加入等量Ficoll400密度梯度液，1 900 r/min離心15 min，取交界面細胞。加入完全培養基(含10%胎牛血清、M199培養基、1%青霉素-鏈霉素溶液、0.5%兩性霉素B和25 ng/mL干細胞因子)重懸細胞，調整細胞密度至1×106/mL，接種于25 cm2培養瓶中(約4 mL/瓶)，于5%CO2、37 ℃細胞培養箱培養。24 h后首次換液，此后細胞換液2～3 d/次，并使用倒置顯微鏡觀察細胞特征及生長狀態。取對數生長期的ICCs進行實驗。

1.3ICCs鑒定采用c-kit特異性抗體免疫熒光染色法。取對數生長期的ICCs，經0.25%胰蛋白酶消化，1 300 r/min離心1.5 min并棄上清，加完全培養基調整細胞密度，將細胞接種于含無菌圓形細胞爬片的24孔板中(1×104/孔)。貼壁24 h后棄去舊培養基，PBS溶液清洗3次，5 min/次。預冷的4%多聚甲醛固定10 min，PBS溶液清洗3次，5 min/次。5%脫脂奶粉封閉10 min，PBS溶液清洗3次，5 min/次。加入兔抗大鼠c-kit抗體(1∶100)，設立陰性對照組以PBS溶液代替c-kit抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。次日使用PBS溶液清洗3次，5 min/次，加入山羊抗兔FITC二抗(1∶200)后于37 ℃孵育1 h, PBS溶液清洗3次。將細胞爬片取出，滴加抗淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4實驗分組與處理采用TM誘導ICCs構建內質網應激模型。參考文獻[8]予2 μg/mL的TM作用6 h時可介導內質網自噬，結合預實驗予4 μmol/mL 3-MA和2 μmol/mL Rapa分別作用ICCs 6 h時細胞的存活率為最高，故以上述濃度進行實驗。將細胞隨機分為4組,ICCs組給予正常培養；ERS組給予2 μg/mL TM處理[8]；3-MA組給予2 μg/mL TM和4 μmol/mL 3-MA聯合作用；Rapa組給予2 μg/mL TM和2 μmol/mL Rapa聯合作用。各組時間均為6 h。

1.5GRP78、LC3B的mRNA表達檢測采用實時熒光定量qPCR法。各組ICCs根據分組要求加入相應的TM、3-MA或Rapa進行干預，采用TRIzol法提取總RNA，用紫外分光光度計測定樣品RNA純度。按照反轉錄試劑盒說明書操作，將總RNA反轉錄為cDNA，于-20 ℃保存備用。進一步以SYBR Premix(10 μL)+cDNA模板(2 μL)+正/反向引物(各1 μL)+無核酸酶超純水(6 μL)的反應體系，上熒光定量PCR儀進行擴增反應。GAPDH為內對照。引物序列：GAPDH正向引物:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，反向引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。GRP78正向引物:5′-ACCTATTCCTGCGTCGGTGT，反向引物:5′-TTCCAAGTGCGTCCGATGAG-3′。LC3B正向引物:5′-CGGAGCTTCGAACAAAGAGTG-3′，反向引物:5′-TGCCTTGGTAGGGGCTTAAC-3′。每個樣品設立3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達量。

1.6各組ICCs活性檢測采用CCK-8法。取對數生長期的ICCs，經消化、離心、收集后，使用完全培養基重懸計數，以1×104/孔的細胞量接種于96孔板中，將培養板放入培養箱(37 ℃、5%CO2條件下)，24 h貼壁后常規更換培養基。按照分組要求加入相應的TM、3-MA或Rapa進行干預，每組重復6個孔，置于培養箱中6 h，每孔分別加入10 μL CCK-8(避免在孔中生成氣泡)，再于培養箱中孵育3 h，用酶標儀測定在450 nm波長處各孔的光密度值(OD值)。實驗重復3次，取平均值。設不含ICCs的培養基為空白孔(Ab)，正常培養的ICCs組為對照孔(Ac)，ERS組、3-MA組和Rapa組為實驗孔(As)，細胞存活率為[(As- Ab)/( Ac- Ab)]×100%。

2　 結果

2.1ICCs鏡下細胞形態及免疫熒光染色鑒定對數生長期的ICCs細胞形態清晰，呈梭形、菱形或三角形，細胞核大、核周胞質少，胞體發出2～5條長突起，與相鄰ICCs的突起、胞體緊密連接成網絡狀，如圖1A。c-kit蛋白為ICCs的特異性蛋白，c-kit免疫標志的熒光染色法可對ICCs細胞進行特異性鑒定，如圖1B所示，陽性表達呈綠色。

圖1　ICCs的形態及熒光鑒定(×200)

2.2各組GRP78、LC3B mRNA表達比較與ICCs組比較，ERS組、3-MA組和Rapa組的GRP78、LC3B的mRNA表達均升高(P均<0.05)。與ERS組比較，3-MA組的GRP78 mRNA表達升高(P<0.05)，LC3B mRNA表達降低(P<0.05)；Rapa組的GRP78 mRNA表達降低(P<0.05)，LC3B mRNA表達升高(P<0.05)。見表1。

表1　各組GRP78、LC3B的mRNA表達比較

注：與ICCs組比較，*P< 0.05；與ERS組比較，#P<0.05。

2.3各組ICCs活性比較與ICCs組比較，ERS組、3-MA組和Rapa組細胞活性的OD值均降低(P均<0.05)；與ERS組相比，3-MA組細胞活性的OD值降低(P<0.05)，Rapa組細胞活性的OD值升高(P<0.05)。見表2。

表2　各組ICCs活性情況比較

注：與ICCs組比較，*P<0.05；與ERS組比較，#P<0.05。

3　討論

胃腸道的慢波節律紊亂和神經遞質信號傳導異常是胃腸動力障礙性疾病發生的共同原因，Cajal間質細胞是胃腸動力的基本單位，各種應激導致該細胞生理功能異常是多種胃腸疾病的關鍵機制[9]。已有臨床研究證實諸多胃動力障礙性疾病，如賁門失弛緩癥[10]、胃輕癱[11]、慢性特發性腸梗阻[12]及慢性傳輸型便秘[13]等與ICCs的功能異常有關。因此，修復ICCs的應激損傷，恢復細胞內穩態是促進胃腸動力的基礎。原代培養的大鼠胃竇ICCs較好保存了原組織細胞的遺傳特征和生物學特性，為研究胃腸動力障礙性疾病的發病機制提供了細胞模型。本實驗根據鏡下細胞形態學特征和免疫熒光染色鑒定[7]，結果提示所培養的原代細胞為ICCs。

既往認為，自噬是非特異性降解細胞內成分及細胞器的代謝過程，但最新研究發現，部分自噬具有選擇性，如內質網應激可介導自噬[14]。內質網是蛋白質合成、折疊和分泌的重要場所，起到調節細胞內穩態的重要作用。然而，細胞在受到氧化應激、細胞能量水平下降、鈣代謝紊亂等生理和病理因素的刺激下，內質網會出現未折疊或錯誤折疊蛋白的大量積累，引起內質網損傷，最終導致ERS反應。此時，內質網分子伴侶GRP78解離，參與調控未折疊蛋白反應，因此GRP78被作為ERS發生的標志性分子[15]。當未折疊或錯誤折疊蛋白過多，形成聚泛素化、穩定難溶而且對蛋白酶體功能有一定毒性的蛋白聚集物時，將激活自噬清除細胞內受損的內質網，消除未折疊蛋白反應和降解有毒蛋白質聚集物，維持細胞的存活[16]。自噬發生時，LC3B結合并始終位于自噬體膜上，被作為檢測自噬表達水平的特異性方法[17]。本實驗以經典的ERS誘導劑TM作用于ICCs構建ERS模型，與ICCs組比較，ERS組GRP78的mRNA表達升高，提示ERS模型成立。同時，LC3B表達亦升高，說明在ICCs的ERS過程中伴隨內質網自噬的發生。

巨自噬是最常見的自噬形式，是非選擇性的形成雙層膜包裹的自噬體，再與溶酶體融合為自噬溶酶體的過程，巨自噬具有雙向調節作用[5]。Bernales等[4]在酵母中發現ERS的未折疊蛋白反應可引起內質網膨脹并重構，重構的內質網被雙層膜包裹擴展成囊泡，采用特異性內質網蛋白免疫標記證實囊泡膜來自內質網，因此提出這種選擇性自噬為內質網自噬。同樣，內質網自噬存在雙向調節作用[18]。ERS時，內質網自噬降解受損內質網積累的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白，從而預防疾??；但在病理情況下，過度激活的自噬亦可清除正常的內質網結構，反而使機體病變加劇。本研究結果表明，與ERS組比較，用自噬抑制劑3-MA干預后GRP78的表達升高，用自噬誘導劑Rapa干預后GRP78表達降低，且CCK-8法檢測結果進一步證實了3-MA使 ICCs的活性下降，而Rapa使ICCs的活性升高，結果提示內質網自噬可減輕ICCs的ERS損傷。

綜上所述，ICCs的ERS過程伴發內質網自噬，內質網自噬可減輕ICCs的ERS損傷。在胃腸動力障礙疾病中，如能通過促進內質網自噬以維持ICCs的存活，將為改善胃動力障礙提供新的靶點。但ERS介導ICCs內質網自噬的具體分子機制尚未明確，仍需進一步研究。

參考文獻：

[1] Sanders KM. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract[J]. Gastroenterology, 1996,111(2):492-515.

[2] Geraldino R, Ferreira A, Lima M, et al. Interstitial cells of Cajal in patients with chagasic megacolon originating from a region of old endemicity[J]. Pathophysiology, 2006,13(2):71-74.

[3] Ueshima S, Nishida T, Koike M, et al. Nitric oxide-mediated injury of interstitial cells of Cajal and intestinal dysmotility under endotoxemia of mice[J]. Biomedical Research, 2014,35(4):251-262.

[4] Bernales S, Schuck S, Walter P. ER-phagy: selective autophagy of the endoplasmic reticulum[J]. Autophagy, 2007,3(3):285-287.

[5] Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, et al. Autophagy in health and disease. 1. Regulation and significance of autophagy: an overview[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2010,298(4):C776-C785.

[6] 張智,凌江紅,寧海恩,等.柴胡疏肝散含藥血清對大鼠胃Cajal 間質細胞增殖及細胞周期的影響[J].世界華人消化雜志,2015,23(30):4792-4799.

[7] 寧海恩,凌江紅,張智,等.酶解法分離與同源血清培養SD大鼠胃Cajal間質細胞的實驗研究[J].廣西中醫藥大學學報,2016,19(1):8-12.

[8] Ogata M, Hino S, Saito A, et al. Autophagy is activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(24):9220-9231.

[9] Yin J, Chen JD. Roles of interstitial cells of Cajal in regulating gastrointestinal motility: in vitro versus in vivo studies[J]. J Cell Mol Med, 2008,12(4):1118-1129.

[10] Villanacci V, Annese V, Cuttitta A, et al. An immunohistochemical study of the myenteric plexus in idiopathic achalasia[J]. J Clin Gastroenterol, 2010,44(6):407-410.

[11] Forster J, Damjanov I, Lin Z, et al. Absence of the interstitial cells of Cajal in patients with gastroparesis and correlation with clinical findings[J]. J Gastrointest Surg, 2005,9(1):102-108.

[12] Streutker C, Huizinga J, Campbell F, et al. Loss of CD117 (c-kit)-and CD34-positive ICC and associated CD34-positive fibroblasts defines a subpopulation of chronic intestinal pseudo-obstruction[J]. Am J Surg Pathol, 2003,27(2):228-235.

[13] Lee JI, Park H, Kamm MA, et al. Decreased density of interstitial cells of Cajal and neuronal cells in patients with slow‐transit constipation and acquired megacolon[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2005,20(8):1292-1298.

[14] Kouroku Y, Fujita E, Tanida I, et al. ER stress (PERK/eIF2 [alpha] phosphorylation) mediates the polyglutamine-induced LC3 conversion, an essential step for autophagy formation[J]. Cell Death Differ, 2007,14(2):230.

[15] Chen HY, Tsai WC, Chiu YL, et al. Triglyceride to high-density lipoprotein cholesterol ratio predicts cardiovascular outcomes in prevalent dialysis patients[J]. Medicine, 2015,94(10):e619.

[16] Volmer R, van der Ploeg K, Ron D. Membrane lipid saturation activates endoplasmic reticulum unfolded protein response transducers through their transmembrane domains[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(12):4628-4633.

[17] Mizushima N. Methods for monitoring autophagy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004,36(12):2491-2502.

[18] Ameri K, Harris AL. Activating transcription factor 4[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008,40(1):14-21.