Gli1對人肝癌細胞中Twist1蛋白表達及細胞遷移的影響

甘魯慧，呂沐瀚，鄧明明

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

肝細胞癌近年發病率高，是癌癥相關死亡的第三大原因[1]。其中，肝細胞癌的高異質性是導致癌細胞復發轉移擴散的關鍵因素[2]。因此，闡釋其侵襲、轉移機制是防治肝細胞癌的關鍵。文獻證實，上皮細胞間質轉化(EMT)是上皮細胞丟失細胞間連接而獲得間質細胞特性的生物轉化過程，是腫瘤侵襲轉移的重要特征，而通過調控EMT可促進肝癌細胞侵襲轉移[3]。研究發現，Hedgehog信號通路參與生物體內細胞的增殖、發育[4]，Hedgehog信號激活通路中關鍵蛋白Gli1轉位進入細胞核內,干預下游靶基因參與調控EMT。在下游的核轉錄因子中，Twist1在轉錄水平上抑制E-Cadherin表達，誘導EMT形成[5]。然而，Gli1是否會通過Twist1而實現調控人肝癌細胞的增殖遷移尚不清楚。2017年9月，我們通過篩選Gli1高表達細胞系構建穩定的GLi1siRNA，探討Hedgehog信號通路關鍵蛋白Gli1對人肝癌細胞中Twist1蛋白表達及增殖遷移的影響。

1　材料與方法

1.1材料 Huh7、hepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五種人肝癌細胞購自中科院上海細胞庫。根據網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得Gli1基因的cDNA序列，采用在線設計工具設計siRNA，經BLAST比對分析與人類其他基因編碼序列無同源性，在候選靶序列中選取3條序列：GLi1siRNA1:5′-GCACCAAACGCTATACAGA-3′;GLi1siRNA2:5′- CTCCACAGGCATACAGGAT-3′;GLi1siRNA3:5′-TCATACTCACGCCTCGAAA-3′，設計陰性對照，由廣州銳博生物公司合成。兔抗人Gli1、Twist1、E-cadherin、N-Cadherin和Vimentin單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體及二抗均購自美國Santa Cruz公司，逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、擴增試劑盒(SYBR ? Premix Ex TaqTM Ⅱ)(TaKaRa 公司)。

1.2細胞系Gli1蛋白表達檢測采用Western blotting技術，主要操作流程參照文獻[6]。移除細胞培養液，用預冷PBS液洗3次，加入蛋白裂解液后冰浴超聲勻漿30 min，4 ℃，12 000 g離心15 min，去除上清液，BCA法測定各組蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。取40 μg總蛋白經12%SDS-PAGE凝膠分離，冰水環境、40 V恒壓轉膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗后加入Gli1一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3次后加入二抗37 ℃ 2 h。TBST清洗后于Image Lab系統下顯影成像，以目的蛋白/GAPDH條帶灰度值作為其相對表達量。

1.3質粒轉染參考文獻[7]，將1.2步驟中篩選的Gli1高表達人肝癌細胞系于生長對數期時，將3個重組質粒(廣州銳博生物公司提供)轉染，分別為pGCsi-U6-GLi1siRNA-1(siRNA-1組)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-2(siRNA-2組)、pGCsi-U6-GLi1siRNA-3(siRNA-3組)，而空白對照組(N組)不轉染任何序列，陰性對照組轉染陰性對照序列(NC組)。各組質粒DNA均采用4 μg，6 h后棄轉染復合物，加入 DMEM/F12條件培養液中繼續培養48 h。

1.4Gli1 mRNA相對表達量檢測采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，操作步驟：于培養48 h后，收集轉染細胞，用TRIzol法提取總RNA，用ddH2O稀釋1 μL樣品200倍后測定RNA濃度與純度。引物由Primer軟件設計、Takara公司合成，參照反轉錄試劑盒說明 ，42 ℃反轉錄50 min，95 ℃ 5 min滅活反轉錄酶。Gli正向引物:5′-CCAGCCAGAGAGACCAACAG-3′,反向引物:5′-CCCGCTTCTTGGTCAACTT-3′,GAPDH正向引物:5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′,反向引物:5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′，其反應體系為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)12.5 μL、正反向引物各1 μL、cDNA 2 μL和dH2O 8.5 μL，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。定量分析mRNA采用2-ΔΔCt法進行計算。Western blotting技術主要操作流程同1.2步驟。

1.5細胞遷移距離測算進行細胞劃痕實驗。實驗步驟參考文獻[8]，用10 μL的槍頭在下室細胞中垂直與6孔板劃兩條垂直交叉的劃痕，PBS清洗每孔3次，清洗劃掉的細胞，然后加入無血清培養液，用倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)拍照，放入培養箱繼續培養24 h后再次拍照。用倒置熒光顯微鏡拍照內置軟件(cellSens Standard)計算出細胞遷移距離。

1.6細胞中Twist1蛋白、E-Cadherin蛋白表達檢測采用Western blotting技術。主要操作流程同1.2步驟。其中Twsit1一抗稀釋度為1∶1 000，E-Cadherin一抗稀釋度為1∶1 000。

2　結果

2.1五種高轉移性人肝癌細胞中Gli1蛋白表達比較 Gli1蛋白在五種高轉移性人肝癌細胞Huh7、SMMC-7721、PLC、HepG2、Bel-7404中相對表達量分別為0.12±0.04、0.39±0.08、0.41±0.05、0.38±0.06、0.76±0.13，經LSD-t檢驗，Gli1蛋白在Bel-7404細胞中相對表達量高于其他細胞中(P均<0.05)，Gli1蛋白在Huh7細胞中相對表達量低于SMMC-7721、PLC、HepG2細胞中(P均<0.05)，Gli1蛋白在SMMC-7721、PLC、HepG2細胞中的表達差異無統計學意義。

2.2各組轉染細胞中Gli1 mRNA和蛋白表達比較選擇Gli1蛋白表達量最高的Bel-7404細胞進行轉染，N組、NC組、GLi1siRNA1組、GLi1siRNA2組、GLi1siRNA3組細胞中Gli1蛋白相對表達量分別為0.64±0.08、0.60±0.03、0.18±0.05、0.07±0.02、0.19±0.02。三種GLi1siRNA對Gli1蛋白抑制率分別為71.86%、89.06%、70.77%(P=0.000)。經 LSD-t檢驗，Gli1蛋白在GLi1siRNA2組轉染細胞中相對表達量低于其他組(P均<0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示，N組、NC組、GLi1siRNA1組、GLi1siRNA2組、GLi1siRNA3組細胞中Gli1 mRNA相對表達量分別為0.85±0.12、0.80±0.06、0.37±0.07、0.15±004、0.35±0.05。三種GLi1siRNA均對Gli1 mRNA產生了較好的抑制效果，抑制率分別為75.74%、90.06%、71.52%(P=0.000)。Gli1 mRNA在GLi1siRNA2組轉染細胞中相對表達量低于其他組(P均<0.05)。

2.3細胞遷移距離比較將篩選的Gli1抑制效果最佳的GLi1siRNA2組細胞、N組細胞進行劃痕實驗比較，在劃痕24 h后，與N組比較，GLi1siRNA2組細胞的劃痕間距值增加，細胞的遷移距離降低(P均<0.05)，提示GLi1siRNA2組細胞的遷移、修復能力降低。N組、GLi1siRNA2組細胞的劃痕間距值分別為(103.87±16.39)、(458.78±40.55)μm。

2.4EMT相關蛋白表達檢測結果N組、GLi1siRNA2組Twsit1蛋白相對表達量分別為1.12±0.15、0.53±0.12，E-Cadherin蛋白相對表達量分別為0.22±0.05、0.72±0.14，N-Cadherin蛋白相對表達量分別為0.81±0.11、0.26±0.04，Vimentin蛋白相對表達量分別為0.66±0.14、0.17±0.03，GLi1蛋白相對表達量分別為0.65±0.08、0.17±0.03。經兩獨立樣本t檢驗，與N組比較，GLi1siRNA2組的Twsit1、GLi1、N-Cadherin和Vimentin蛋白相對表達量降低，E-Cadherin蛋白相對表達量增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)。

3　討論

Hedgehog信號通路在腫瘤的細胞增殖、細胞周期調控、侵襲轉移等病理生理過程發揮重要作用，甚至與腫瘤耐藥密切相關[9]。在人肝細胞癌中，Hedgehog信號通路中的Gli1在臨床肝細胞癌組織標本中有較高的陽性表達率且與腫瘤分化程度和淋巴結轉移相關，可能作為判斷肝細胞癌惡性程度及預后的指標[10]?；A研究證實[11]，阻擋Gli1可抑制人肝癌細胞的侵襲與轉移。為研究Hedgehog信號通路關鍵蛋白Gli1對人肝癌細胞中Twist1蛋白表達及增殖遷移的影響，我們通過在 Huh7、HepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五種細胞中，通過Western blotting篩選出Gli1高表達的Bel-7404進行了siRNA干預，在設計的三組siRNA中，挑選抑制Gli1效率最高的組進行分析Bel-7404細胞Twist蛋白表達情況和遷移修復能力。本研究結果顯示，通過siRNA沉默Gli1后，成功抑制了人肝癌Bel-7404細胞的侵襲與轉移，此與Chen等[12]研究結果一致。研究發現，Gli1產生這種效應的機制可能與在轉錄水平上調轉化因子β1受體、C端結合蛋白2[13]等促進肝癌細胞EMT。而Twist1可顯著性促進癌細胞EMT[14]，抑制Twist1可限制腫瘤轉移甚至逆轉其耐藥性[15]，這可能與Twist1作用于PcG家族中的Bmi1基因促進了腫瘤細胞向干細胞分化[16]，而Twist1又可接受腫瘤微環境中促炎性因子TNF-α通過經典的NF-κB通路誘導[17]，形成一個正反饋放大通路。但Twist1表達是否接受Gli1調控仍未知。在本研究中通過抑制Gli1的同時，Twist1表達量顯著性下調，而人肝癌Bel-7404細胞中EMT的特征性蛋白E-Cadherin卻表達增加，N-Cadherin和Vimentin下調。提示Gli1可能作用于Twist1而實現EMT的調節。

Gli1是Hedgehog信號通路中的重要轉錄因子，Hedgehog信號通路與腫瘤的細胞增殖、侵襲轉移密切相關[9]。而Twist1可顯著性促進肝癌細胞EMT[14]，上皮間質化是肝癌細胞侵襲轉移的重要原因，在出現 EMT 時,可視為肝癌細胞侵襲轉移的開始。在EMT過程中的特征性變化包括：上皮細胞的標志E-Cadherin下調、β-catenin 的核轉位聚集，間質細胞的標志N-Cadherin、Vimentin上調等[16,17]。

綜上所述，siRNA沉默Hedgehog信號通路關鍵蛋白Gli1后，Twist1下調，EMT抑制，提示在人肝癌細胞Bel-7404中，Hedgehog/Gli1通路可能通過作用于Twist1而實現EMT的調節，此將為肝細胞癌的發生機制研究與防治工作提供參考。但本研究尚未觀察Gli1與Twist1的相互作用，亦未驗證肝癌臨床標本中二者在病理檢測中的相關性，有待于后續探究。

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