外加碳源對耐高溫采油菌株ZY-3生長和代謝的影響

司偉民,王佳新,凌 猛,孫玉梅*

1.大連工業大學生物工程學院,遼寧 大連 116034

2.中國輕工業武漢設計工程有限責任公司,湖北 武漢 420100

3.華潤雪花啤酒（中國）有限公司煙臺分公司,山東 煙臺 264000

微生物采油（Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR）是指將篩選到的適宜微生物與相應的培養液注入油層，或只添加適宜的培養液以促進油層中的微生物生長和代謝進而提高原油開采的方法[1]。該方法一方面通過微生物直接作用原油（對原油的降解作用），改善原油物性（降低凝固點、臨界溫度和黏度等），促進原油在巖層空隙中的流動；另一方面利用微生物代謝物（氣體、聚合物、生物表面活性劑、有機酸、溶劑等）改善原油理化性質，提高石油的產量或采收率[1,2]。這項技術的關鍵是篩選能在油藏條件下生長繁殖的菌種，以及選擇出適合微生物生長代謝并促進采油的營養物質配比[3-5]。

國內早期主要是通過篩選適宜菌種進行研究，這類菌株通常能在油層環境中生長[6]。以高蠟原油為唯一碳源篩選出的在60℃緩慢生長的采油菌株，能夠降解正構高碳烷烴，可使原油中含蠟量及原油界面張力下降，促進原油采集[7]。以石油烴類為唯一碳源的菌株作用原油后，原油輕質組分增加，粘度、有機酸含量、界面張力等理化性質有所改變，大幅度提高原油采收率[8]。采油微生物以地層石油為碳源代謝速率和程度較低。利用葡萄糖生長時，芽孢桿菌可使采收率提高[9]。以2.0%淀粉水解液和0.3%(NH)2HPO4可構建采油培養基[10]。添加含有淀粉和纖維素的營養劑，能夠在有氧和無氧條件下促進本源菌群的生長，并產生對原油有較好的乳化作用的生物氣(CH4和CO2)和表面活性物質(帶C8～C12長鏈脂肪酸的鼠李糖脂)，提高采收達12%～20%[11]。

本研究采用的耐高溫采油菌株ZY-3，在前期研究中已證明菌株為芽孢桿菌屬，產糖脂類陰離子表面活性劑[12]。本文主要針對菌株利用不同碳源生長和培養液表面張力及其乳化活性進行比較，為較深入地評價菌株的采油特性和探討菌株的采油應用可能性和條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

耐高溫采油菌株ZY-3分離自遼河油田原油，由本實驗室鑒定并保存。

1.2 實驗試劑

液體石蠟、可溶性淀粉為化學純，葡萄糖、木糖、環己烷、石油醚為分析純。

1.3 實驗儀器

WFJ 7200型可見光分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；Jzhy1-180界面張力儀，承德大華試驗機有限公司；日立CR21G高速冰凍離心機，日本HITACHI公司；303-6A型數顯電熱保溫箱，上海陽光實驗儀器有限公司；GC-8900氣相色譜儀，滕州市經緯分析儀器有限責任公司；低噪高空氣泵，北京中興匯利科技發展有限公司；氫氣發生器，山東塞克賽斯氫能源有限公司。

1.4 培養基

菌種活化培養基（g/L）：NaCl 5.0，牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，瓊脂20.0，pH7.0。

液體種子培養基（g/L）：NaCl 5.0，牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，pH7.0。

發酵培養基（g/L）：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34.112，MgSO4·7H2O 0.2，酵母粉0.2，液體石蠟17.0，碳源2.0。碳源分別為：木糖、葡萄糖、淀粉，pH7.0。

上述培養基于121℃滅菌20 min。

1.5 菌種活化及種子液制備

取-80℃保存的菌種，接種于活化培養基，在60℃下培養24 h。將活化菌體以2環/100 mL的接種量接與液體種子培養基，在60℃下培養24 h。

1.6 菌株對不同碳源的作用效果

在發酵培養基中接入5%活化種子，于60℃靜置培養7 d。每24 h取樣測定菌體密度（OD600）、表面張力、乳化活性、殘糖及石蠟的含量。

1.7 測定方法

菌體密度：采用濁度法。將4 mL除油發酵液與0.5 mL TritonX-100（0.2%）的混合溶液漩渦振蕩1 min，于3000 g離心20 min，去上清，用4 mL去離子水重懸菌體，以去離子水為空白，于600 nm測定菌懸液光密度OD600[12]。

表面張力儀測定表面張力：將除油發酵液于3000 g離心20 min除菌，取上清液測定[12]。

乳化活性：取1.5 mL除油發酵液與1 mL石蠟的混合液漩渦振蕩5 min，靜置，于24 h后測量乳化層和液體總高度。乳化層高度與液體總高度之比即乳化活性[13]

還原糖含量：采用DNS法[14]。

氣相色譜法測定石蠟含量：進樣口溫度：280℃，FID檢測器溫度：300℃，初始柱溫：80℃。以5℃/min升至200℃，維持2 min，繼續以8℃/min升至280℃，維持30 min。進樣量：0.2 μL[12]。

淀粉含量：采用苯酚-硫酸法[15]。

2 結果與討論

2.1 以木糖和液體石蠟為碳源的生長與代謝

圖1 菌株ZY-3在木糖和石蠟中的代謝Fig.1 Metabolism of strain ZY-3 in the medium with xylose and paraffin

利用木糖-石蠟混合碳源時，菌株ZY-3生長較好，其次為木糖碳源。菌體利用石蠟時生長較差（圖1）。

石蠟碳源和木糖-石蠟混合碳源的石蠟消耗速率均在前3 d較大，分別消耗67.8%和68.6%，4～7 d時消耗減慢，分別消耗13.05%和8.41%，整個過程的總消耗率分別為80.85%和77.01%。木糖碳源以及木糖-石蠟混合碳源也均在前3 d表現出較大的木糖消耗速率，分別消耗71.6%和57.4%，4～7 d則消耗減慢，分別消耗19.8%和19%，整個過程的總消耗率分別為91.45%和76.41%。以此可見，木糖-石蠟混合碳源可促進菌株生長，但不利于菌體對石蠟的利用。

在發酵期間，木糖碳源的發酵液表面張力最高，而在發酵前期石蠟碳源發酵液表面張力較低，木糖-石蠟混合碳源其發酵液表面張力在發酵后期時較低。木糖和木糖-石蠟混合碳源發酵液的乳化活性均比石蠟碳源的高。可見，菌體利用木糖-石蠟混合碳源有助于生物表面活性劑的合成，可使發酵液表面張力更低，乳化能力更強。

2.2 以葡萄糖和液體石蠟為碳源的生長與代謝

由圖2可知，利用葡萄糖碳源時，菌株ZY-3的生長速度和生長量均較高，其次為利用石蠟碳源的生長，利用葡萄糖-石蠟混合碳源在0～3 d時生長較差，而之后則接近葡萄糖碳源的生長。以石蠟和葡萄糖-石蠟為碳源，石蠟碳源的石蠟在0～3 d內共消耗67.8%，在4～7 d內共消耗13.05%，整個過程的總消耗率為80.85%。葡萄糖-石蠟混合碳源的石蠟在0～3 d內共消耗50.5%，而4～7 d內共消耗33%，總消耗率為83.54%。葡萄糖碳源的葡萄糖0～3 d內共消耗64.8%，在4～7 d內共消耗26.11%，整個過程的總消耗率為90.91%。葡萄糖-石蠟混合碳源的葡萄糖在0～3 d內共消耗63.6%，在4～7 d內則消耗21.8%，總消耗率為85.40%。可見，葡萄糖-石蠟混合碳源不利于菌株生長，但對石蠟的利用則略有促進。

圖2 菌株ZY-3在葡萄糖和石蠟中的代謝Fig.2 Metabolism of strain ZY-3 in the medium with glucose and paraffin

石蠟碳源發酵液表面張力在0～3 d內較低，而在4～7 d內葡萄糖碳源和葡萄糖-石蠟混合碳源二者的發酵液表面張力均較低，其中最低的為混合碳源。在整個發酵過程中，葡萄糖碳源以及葡萄糖-石蠟混合碳源的乳化效果較好，石蠟碳源發酵液的乳化較差。結果表明，菌體利用葡萄糖-石蠟混合碳源生長時更有利于合成生物表面活性劑。

2.3 以淀粉和液體石蠟為碳源的生長與代謝

如圖3可知，菌株ZY-3利用淀粉碳源生長量和生長速度較高，其次為利用石蠟碳源的生長，利用淀粉-石蠟混合碳源的生長較差。

石蠟碳源的石蠟與淀粉-石蠟混合碳源的石蠟的總消耗率分別為80.85%和70.39%。淀粉碳源和淀粉-石蠟混合碳源的淀粉總消耗率分別為89.91%和79.29%。由此可見，淀粉-石蠟混合碳源對菌株ZY-3生長及其對石蠟的利用有不利影響。

石蠟碳源在第0～3 d內發酵液有較低的表面張力，淀粉-石蠟混合碳源發酵液表面張力則在第4～7 d較低，淀粉碳源的發酵液有較高的表面張力。在發酵期間，發酵液乳化活性較高的是淀粉碳源和淀粉-石蠟混合碳源。可見，淀粉-石蠟混合碳源更有利于合成生物表面活性劑，從而使發酵液表面張力更低，乳化能力更強。

圖3 菌株ZY-3在淀粉和石蠟中的代謝Fig.3 Metabolism of strain ZY-3 in the medium with starch and paraffin

3 討論

比較菌株ZY-3以木糖、淀粉和葡萄糖為唯一碳源的碳源消耗，對葡萄糖消耗速率最快，木糖次之，淀粉最慢。比較石蠟與糖混合碳源的石蠟消耗，與葡萄糖混合的石蠟消耗速率最快（但在第一天后消耗速度減小），與木糖混合的石蠟消耗次之，與淀粉混合的石蠟消耗最慢。木糖和淀粉與石蠟的混合均比單獨木糖和淀粉的糖消耗慢且少，只有葡萄糖與石蠟的混合比單獨葡萄糖的糖耗快。木糖的存在對菌體ZY-3利用石蠟的速度和利用量無大影響。菌株ZY-3在石蠟與葡萄糖共存時優先利用葡萄糖，在石蠟和木糖共存時優先利用石蠟生長。菌株ZY-3利用葡萄糖生長量最大也最快，其次是利用淀粉的生長，利用木糖的生長最慢但較多。在糖與石蠟為混合碳源時，利用木糖石蠟混合碳源的細胞生長最快且最多。

4 結論

石蠟與葡萄糖、木糖以及淀粉的混合碳源有利于促進菌株代謝環境的表面張力和乳化活性降低，石蠟與木糖的混合碳源也有利于細胞生長，石蠟與葡萄糖以及與淀粉的混合碳源不明顯促進細胞生長，淀粉能明顯減少石蠟的消耗。對菌株ZY-3，在采油過程中，可適當添加淀粉促進生物表面活性劑的產生，使短鏈烷烴的消耗量減少，達到促進原油采集的目的。添加葡萄糖亦有類似效果，但較之淀粉則略有不如。添加木糖雖然不能減少對石蠟的消耗，但由于其明顯促進細胞生長并在一定程度上促進生物表面活性劑合成（表現在一定程度減低表面張力），也具有一定的應用價值。

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