繡球菌多糖超聲波修飾條件的響應面優化*

張 迪，王宏雨，林衍銓

（福建省農業科學院食用菌研究所，福建 福州 350014）

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia） 是新開發的珍稀食（藥）用菌，目前該品種的人工栽培技術已實現了工廠化周年生產，可穩定供應市場。廣葉繡球菌（下文簡稱繡球菌）子實體中含有大量的β-葡聚糖，現有研究表明繡球菌中的β-葡聚糖成分能夠提高人體免疫力和造血功能，同時對某些腫瘤也具有一定的預防和抑制作用，具有抗癌、防癌的保健價值[1-2]。通過前期研究發現，繡球菌凍干品中提取的繡球菌多糖分子量高達400 kDa，存在溶解困難、溶液粘度大等缺點，有必要通過適當的分子修飾提高其溶解性，降低溶液粘度，提高活性。

近年來天然多糖的提取、改性以及結構分析成為研究的熱點，超聲波修飾主要是對多種生物大分子（如葡聚糖、DNA等）進行結構修飾。原理是利用增加質點震動能量來切斷生物大分子中的某些特定的化學鍵（糖苷鍵），以降低分子量，增加水溶性，提高生物學活性[3-4]。目前關于繡球菌多糖的化學和物理修飾的研究鮮有報道，本文采用超聲波對繡球菌多糖進行分子修飾，分析超聲波功率、時間、物料濃度對超聲波修飾后的繡球菌多糖的DPPH自由基清除率的影響，并以DPPH自由基清除率為考察指標，對繡球菌多糖的超聲波修飾條件進行響應面優化，確立較優的超聲波修飾工藝條件。

1　材料與方法

1.1　供試材料

繡球菌子實體鮮品，由福建天益菌業有限公司提供。

1.2　試劑與儀器設備

試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH（WAKO公司），實驗用水為超純水，其余試劑均為國產分析純、色譜純。

儀器：JY92-IIDN超聲波破碎儀，上海凈信實業有限公司；Centrifuge 5804-R離心機，德國艾本德公司；EPOCH2TC酶標儀，美國BioTek公司；真空冷凍干燥機，北京博醫康有限公司；超純水器，優普公司。

1.3　試驗方法

1.3.1繡球菌多糖制備

干燥：采用真空冷凍干燥對繡球菌鮮品進行干燥，干燥條件為-35℃、預凍24 h，冷阱溫度-60℃，擱板溫度30℃，干燥時間30 h。收獲干品后用高速粉碎機粉碎過60目篩，備用。

熱水提?。毫弦罕?∶15，100℃水浴攪拌提取2 h，一次投料量為50 g干粉。提取液過濾后濾液經8000 r·min-1、離心10 min取上清，減壓濃縮至原體積一半后加入4倍體積95%的乙醇醇沉過夜，醇沉液8000 r·min-1離心20min取沉淀，沉淀真空干燥后即得繡球菌粗多糖。繡球菌粗多糖用蒸餾水復溶為 15 mg·mL-1的溶液，8000 r·min-1離心 10 min取上清液備用。

脫蛋白：采用三氯乙酸法[5]，取濃度15mg·mL-1的繡球菌粗多糖液，加入糖液體積10%的40%TCA溶液，混勻靜置30 min，8000 r·min-1離心20 min，棄沉淀，重復3次。脫蛋白后的多糖用4倍體積乙醇醇沉，再用丙酮洗滌沉淀2次，真空干燥后得到繡球菌多糖。

1.3.2繡球菌多糖的DPPH自由基清除能力的測定

參考王金璽[6]的方法略作改動，采用96孔板進行測定，將待測樣品統一稀釋至質量濃度2mg·mL-1進行測定，每孔樣品溶液150μL，加入50μL用無水乙醇配制的DPPH溶液（2.5×10-4mol·L-1），振蕩混勻后置于暗處，室溫下反應30 min，用無水乙醇調零，在波長517 nm處測定吸光值記為Ax；空白組中的樣品用50μL無水乙醇替代，其余處理同上，在波長517 nm處測定吸光值記為A0；對照組中的DPPH溶液用50μL無水乙醇替代，其余處理同上，在波長517 nm處測定吸光值記為Ax0，每個樣品溶液平行試驗3次。

DPPH自由基清除率（SR）公式為：

1.3.3繡球菌多糖超聲波修飾的響應面優化試驗

在前期單因素試驗的基礎上，采用Design Expert 8.0軟件，根據Box-Behnken中心設計原理，設計三因素三水平響應面分析試驗。以繡球菌多糖的DPPH自由基清除率為響應值，料液濃度、超聲功率、超聲時間3個因素作為自變量，對繡球菌多糖的超聲波修飾工藝條件進行優化分析。

2　結果與分析

2.1　繡球菌多糖超聲波修飾的響應面試驗結果

通過Design Expert8.0統計軟件，采用三因素三水平的響應面進行設計，考慮各因素間的交互作用以及各因素對DPPH自由基清除率的影響，試驗設計如表1和表2所示。

表1　響應面試驗因素編碼和水平Tab.1　Factors code and levels of variablels for response surface test

通過對試驗結果進行擬合，得到DPPH自由基清除率與料液濃度、超聲功率、超聲時間之間的二次多元回歸模型：

經Design Expert 8.0軟件對17個點的繡球菌多糖的DPPH自由基清除率進行回歸統計分析得出回歸模型方差分析表，如表3所示。

表2　響應面分析試驗設計與結果Tab.2　Design and results of response surface analysis

從表3可見，回歸模型P＜0.01（P=0.0065），達到極顯著水平，失擬項P＞0.05（P=0.0862） 不顯著，R2=0.9092，擬合程度尚可，說明該模型成立，理論推測可用?；貧w方程系數顯著性檢驗結果表明，方程中的超聲時間（C）、超聲功率（B） 及其二次項（B2），對DPPH自由基清除率具有極顯著的影響（P＜0.01）；超聲時間的二次項（C2）對DPPH自由基清除率影響顯著（P＜0.05），其他變量對DPPH自由基清除率的影響均不顯著（P＞0.05）。由回歸方程可知對DPPH自由基清除率影響最大的因素為超聲時間，其次超聲功率，而料液濃度對提取率的影響不顯著。交互作用方面，超聲處理的料液濃度、功率、時間三者間的所有交互作用對多糖的DPPH自由基清除率的影響均不顯著。

表3　回歸模型的變量方差分析表Tab.3　The ANOVA table of variates

2.2　響應面數據分析和最優工藝條件的確定

等高線的形狀可反映因素之間交互效應的強弱，橢圓形的表示2個因素交互作用強，圓形的則說明2個因素交互作用弱[6]。各因素響應面圖和等高線圖見圖 1～圖 3。

圖1　超聲功率、料液濃度的響應面圖和等高線圖Fig.1　Response surface 3D and corresponding contourmap of the ultrasonic treatment power and concentration

圖2　超聲時間、料液濃度的響應面圖和等高線圖Fig.2　Response surface 3D and corresponding contourmap of the ultrasonic treatment time and concentration

圖3　超聲時間、超聲功率的響應面圖和等高線圖Fig.3　Response surface 3D and corresponding contourmap of the ultrasonic treatment time and power

由圖1、圖2可知，DPPH自由基清除率的極大值都出現在相關因素的高水平組合區間，由等高線可見在高水平區間內的料液濃度與超聲功率、超聲時間間存在一定的互作，但方差分析顯示這些互作效應對模型中的DPPH自由基清除率的影響均不顯著。由圖3可見，超聲功率和超聲時間間基本無互作作用，與方差分析結果相符。

由圖1可見，隨著超聲波處理功率的增大，繡球菌多糖的DPPH自由基清除率出現了先增大后下降的趨勢，這可能是由于超聲波功率過大引起多糖分子交聯，使抗氧化作用下降所致[7]。超聲波作用于糖苷鍵使其發生斷裂是漸進的過程，在功率、糖苷鍵數量恒定的條件下糖苷鍵斷裂的數量隨著超聲時間的增加而增加，逐漸達到飽和值，這與圖2所示繡球菌多糖的DPPH自由基清除率隨著超聲時間的增加而提高，最終趨于穩定，僅出現輕微的下降的情況是相符的。

利用回歸方程進行優化求解，得到超聲波修飾后，繡球菌多糖的DPPH自由基清除率最高預測值為44.96%，對應的最佳工藝條件為：料液濃度8 mg·mL-1，超聲波功率548.82W，超聲時間60 min。根據實際操作條件選取料液濃度8mg·mL-1，超聲波功率550W，超聲時間60 min的工藝條件進行3次驗證試驗取平均值，試驗結果表明超聲波修飾后的繡球菌多糖的DPPH自由基清除率平均值為44.43%，與預測值44.96%接近，擬合度良好，較超聲修飾前的18.73%提高了2.37倍。

3　結論

采用響應面法分析了料液濃度、超聲功率和超聲時間3個因素對繡球菌多糖DPPH自由基清除率的影響，得到DPPH自由基清除率預測值（Y）與料液濃度、超聲功率和超聲時間的二次多元回歸方程：

回歸方程中的超聲時間（C）、超聲時間的二次項（C2）、超聲功率（B）及其二次項（B2），對繡球菌多糖的DPPH自由基清除率具有顯著的影響，其他變量對清除率的影響均不顯著。3個因素對清除率的影響大小依次為：超聲時間＞超聲功率＞料液濃度。

通過回歸方程優化后確定最佳脫色工藝條件為：脫料液濃度8 mg·mL-1，超聲功率550W，超聲時間60 min，該條件下繡球菌多糖的DPPH自由基清除率由未超聲修飾的18.73%提高到44.43%，提高了2.37倍。

參考文獻：

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