結核感染T細胞斑點試驗在不同患者群中的檢測結果分析

尹洪云　WenLing Tan　馬俊　葛燕萍　史祥　肖和平　馮永紅

近年來，結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)為結核病的診斷提供了新途徑，該方法在結核病診斷中的應用價值受到廣泛關注，目前在我國已廣泛開展。但此種檢測方法在結核病診斷應用中的敏感度及特異度的報道相差懸殊[1-9]。本研究從實際工作出發，對結核病診斷的不同層面，包括臨床診斷，病原學診斷，以及經隨訪剔除不符合診斷者后進行重新分組，分析T-SPOT.TB檢測的敏感度及特異度；同時分析可能影響檢測結果的因素，包括年齡、不同類型結核病、結核病史及非結核分枝桿菌(NTM)感染等對T-SPOT.TB檢測結果的影響。

對象和方法

一、研究對象

(一)患者來源

回顧性分析2014年5月至2015年4月間因肺部疾病或疑似結核病入住同濟大學附屬上海市肺科醫院進行T-SPOT.TB檢測的1537例患者?；颊呷朐汉缶炇鹧?、有創檢查及抗結核治療知情同意書。

(二)患者分組

1. 臨床診斷結核病組與臨床診斷非結核病組：以癥狀體征、影像學改變、結核免疫、細菌學檢測等指標進行綜合判斷，再依據中華醫學會結核病學分會編著的《臨床診療指南：結核病分冊》[10]的診斷標準，將1537例患者分為臨床診斷結核病組和臨床診斷非結核病組。臨床診斷結核病組1159例，其中男753例，女406例；年齡3～95歲，平均年齡(43.03±18.69)歲。臨床診斷非結核病組378例，其中男242例，女136例，年齡10～93歲，平均年齡(54.46±16.63)歲。

2. 結核病組與非結核病組：臨床診斷結核病組1159例患者中，共有1133例患者的標本(包括痰液、體液或組織液、氣管鏡刷檢、穿刺、病理)進行了抗酸染色檢測，其中抗酸染色陽性患者306例，抗酸染色陰性患者827 例。臨床診斷結核病組剔除經分枝桿菌培養證實為NTM感染的患者(56例)，作為結核病組(1103例)，包括肺結核557例，結核性胸膜炎107例，淋巴結結核16例，骨關節結核51例，腦結核(結核性腦膜炎5例，腦內結核瘤與結核性腦膜炎共存者2例)7例，其他2種及2種以上組織或器官(包括肺、胸膜、胸壁、淋巴結、骨關節、肝、腹膜、腸道、盆腔、泌尿系、腦)發生的多組織器官結核363例，其他肺外結核2例(包括乳突結核 1例，睪丸結核1例)；其中，經分枝桿菌菌群培養及菌種鑒定確診的結核病患者共229例，其他患者參照文獻[10]的標準進行診斷，并通過隨訪和抗結核藥物治療證實。

臨床診斷非結核病組378例患者中，剔除經隨訪尚不能排除結核病診斷的39例患者，再納入臨床診斷結核病組經培養確診為NTM感染的56例患者，作為非結核病組，共計395例。包括NTM病93例，各種類型肺癌或肺部腫瘤60例，支氣管擴張50例，真菌性肺病16例，肺部炎癥124例，間質性肺病8例，結節病5例，塵肺病3例，風濕類疾病4例，肺膿腫2例，肺栓塞2例，放射性肺炎2例，漏出性或非特異性胸腔積液18例，隱球菌腦膜炎5例，非特異性淋巴結腫大3例。

二、方法

1. T-SPOT.TB檢測試劑盒：采用英國Oxford Immunotec公司生產的T-SPOT.TB試劑盒。

2. T-SPOT.TB檢測方法：次日晨起抽取空腹全血檢測結核感染T細胞，成年人及8歲以上兒童及未成年人8 ml、8歲以下兒童4 ml，等分放入2支肝素抗凝管，采集后立即顛倒抗凝管5～10次，避免血液分層，18～25 ℃保存，于4 h內進行處理，檢測程序按照試劑盒說明書執行。

3. T-SPOT.TB陽性結果判斷標準：以試劑盒說明書判斷抗原A和(或)抗原B孔的反應結果，(1)空白對照孔斑點數為0～5，待測樣本應為抗原A或抗原B斑點數減去空白對照孔斑點數≥6，判斷為陽性，即有反應性；(2)空白對照孔斑點數≥6，待測樣本應為抗原A或抗原B斑點數≥2倍無反應性對照孔的斑點數，判斷為陽性，即有反應性；(3)如果上述標準不符合且植物血凝素對照孔正常時，待測樣本檢測結果為陰性，即無反應性。同時記錄所測樣本的斑點數，不同的反應程度以反應斑點數來判斷，分為0、1～5、6～10、11～50、>50個5個檔次，其中斑點數6～10個為輕度陽性、11～50個為明顯陽性、>50個為超強陽性。

4. 病原學檢測：標本(包括痰液、體液或組織液、支氣管鏡刷檢、病理穿刺檢查等)涂片熒光抗酸染色、分枝桿菌培養等均參照中國防癆協會基礎專業委員會制定的《結核病診斷實驗室檢驗規程》[11]執行。

三、統計學分析

各項指標定義：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%，特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%，陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%，陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%，準確率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%。

結　　果

一、臨床診斷結核病組和臨床診斷非結核病組T-SPOT.TB檢測結果及影響因素

臨床診斷結核病組T-SPOT.TB檢測陽性率為81.97%(950/1159)，陰性率為18.03%(209/1159)；臨床診斷非結核病組T-SPOT.TB檢測陽性率為46.56%(176/378)，陰性率為53.44%(202/378)，兩組差異有統計學意義(χ2=180.60，P=0.000)。以臨床診斷為標準，T-SPOT.TB檢測的敏感度為81.97%(950/1159)，特異度為53.44%(202/378)，陽性預測值為84.37%(950/1126)，陰性預測值為49.15%(202/411)，準確率為74.95%(1152/1537)。

1. 臨床診斷結核病組痰涂片陽性和陰性患者的T-SPOT.TB檢測情況分析：臨床診斷結核病組進行抗酸染色檢測的1133例患者標本中陽性306例，陰性827例?？顾崛旧栃哉逿-SPOT.TB檢測陽性251例，陽性率為82.03%(251/306)；抗酸染色陰性者T-SPOT.TB檢測陽性704例，陽性率為85.13%(704/827)，差異無統計學意義(χ2=1.62，P=0.203)。

2. 臨床診斷結核病組患者年齡對T-SPOT.TB檢測結果的影響：1159例臨床診斷結核病組患者中，T-SPOT.TB檢測陽性的患者(950例)平均年齡為(42.38±18.68)歲，低于T-SPOT.TB檢測陰性的患者[209例；(46.07±18.40)歲]，差異有統計學意義(t=2.59，P=0.010)。

1159例臨床診斷結核病組患者，按年齡段(未成年、中年及老年)分為≤18歲(69例)、19～64歲(922例)、≥65歲(168例)3個年齡組。各年齡組T-SPOT.TB檢測陽性率分別為≤18歲79.71%(55/69)、19～64歲82.32%(759/922)、≥65歲80.95%(136/168)，三組間T-SPOT.TB檢測陽性率差異無統計學意義(χ2=0.43，P=0.805)。

二、結核病組與非結核病組T-SPOT.TB檢測結果及影響因素

結核病組(1103例)與非結核病組(395例)患者T-SPOT.TB檢測敏感度為83.77%(924/1103)，特異度為54.43%(215/395)，陽性預測值為83.70%(924/1104)，陰性預測值為54.57%(215/394)，準確率為76.03%(1139/1498)。結核病組(83.77%)與非結核病組T-SPOT.TB檢測陽性率(45.57%，180/395)比較，差異有統計學意義(χ2=218.97，P=0.000)。

1. 結核病組痰涂片陰性、陽性和結核分枝桿菌培養陽性患者的T-SPOT.TB檢測情況分析：結核病組抗酸染色陽性患者T-SPOT.TB檢測陽性率為90.73%(235/259)，明顯高于抗酸染色陰性患者的陽性率(81.64%，689/844)，差異有統計學意義(χ2=11.41，P=0.001)。

結核病組患者中，共有229例標本進行分枝桿菌培養后菌種鑒定為結核分枝桿菌感染，其中T-SPOT.TB檢測陽性者212例，在結核分枝桿菌培養陽性的結核病組患者中，T-SPOT.TB檢測陽性率為92.58%(212/229)。

抗酸染色陽性的臨床診斷結核病組患者T-SPOT.TB檢測陽性率為82.03%(251/306)，剔除NTM感染患者后，結核病組T-SPOT.TB檢測陽性率上升至90.73%(235/259)，差異有統計學意義(χ2=8.84，P=0.003)。

2. 結核病組不同年齡患者T-SPOT.TB檢測結果的差異：結核病組T-SPOT.TB檢測陽性患者(924例)平均年齡為(42.13±18.66)歲，略低于T-SPOT.TB檢測陰性的患者[179例；(44.56±18.01)歲]，但差異無統計學意義(t=-1.06，P=0.108)。

229例經菌種鑒定確診的結核病患者，按年齡段分為≤18歲(15例)、19～64歲(173例)、≥65歲(41例)。各年齡組T-SPOT.TB檢測陽性率分別為：≤18歲93.33%(14/15)、19～64歲91.33%(158/173)、≥65歲97.56%(40/41)，三組間T-SPOT.TB檢測陽性率差異無統計學意義(χ2=1.89，P=0.389)。

3. 結核病組與非結核病組對T-SPOT.TB抗原反應強度的差異：結核病組與非結核病組排除T-SPOT.TB檢測結果斑點計數缺失的患者(結核病組缺失30例，非結核病組缺失10例)后，兩組對結核特異性A、B抗原反應強度差異均有統計學意義(表1)。結核病組對A、B抗原刺激后斑點數≥1的患者中，明顯陽性及超強陽性(斑點數≥11)的比率分別為69.81%(652/934)及69.67%(627/900)，明顯高于非結核病組的46.83%(96/205)和46.63%(83/178)，差異有統計學意義(Z值分別為-14.20和-14.63，P值均<0.01)，可見斑點數越高，患結核病的可能性越大。結核病組中抗酸染色陰性患者及抗酸染色陽性患者對T-SPOT.TB抗原反應強度差異也有統計學意義(表2)。

4. 結核病組患者T-SPOT.TB檢測情況：單一組織或多組織器官結核病灶發生的部位不同，患者T-SPOT.TB檢測陽性率存在差異(表3)。以淋巴結結核T-SPOT.TB檢測陽性率為最高，隨后依次為多組織器官結核、肺結核、結核性胸膜炎，腦結核、骨關節結核和其他肺外結核陽性率相對較低，差異有統計學意義(χ2=58.72，P=0.000)。

表1　結核病組與非結核病組患者T-SPOT.TB檢測的抗原反應情況

注表中括號外數值為例數，括號內數值為“構成比(%)”；a：結核病組中有1例僅有B抗原刺激值

表2　結核病組中抗酸染色陰性與抗酸染色陽性患者T-SPOT.TB檢測的抗原反應情況

注表中括號外數值為例數，括號內數值為“構成比(%)”；a：結核病組中有1例僅有B抗原刺激值

表3　結核病組不同類型患者T-SPOT.TB檢測情況

注a：其他肺外結核包括乳突結核 1例，睪丸結核1例

5. 非結核病組患者結核感染史對T-SPOT.TB檢測結果的影響：395例非結核病組患者中，既往有結核病史或肺部存在陳舊性病灶者94例，無病史者301例。兩者T-SPOT.TB檢測陽性率分別為69.15%(65/94)和38.21%(115/301)，差異有統計學意義(χ2=27.65，P=0.000)。

6. 確診結核病患者與確診NTM感染患者的T-SPOT.TB檢測陽性率、斑點數及年齡比較：經菌種鑒定確診為結核病的患者(229例)與確診為NTM感染的患者(93例)T-SPOT.TB檢測陽性率分別為92.58%(212/229)和48.39%(45/93)，差異有統計學意義(χ2=68.46，P=0.000)。

229例確診的結核病患者中，223例有T-SPOT.TB斑點值檢測結果(6例患者僅有陰性、陽性判斷結果)，抗原刺激可計斑點數分別為：A抗原陽性率為88.34%(197/223)，B抗原陽性率為78.48%(175/223)，均明顯高于93例NTM感染患者[A抗原陽性率為43.01%(40/93)，B抗原陽性率為37.63%(35/93)]，兩組間差異均有統計學意義(表4)。

229例確診結核病患者平均年齡為(45.19±18.94)歲，93例NTM感染患者平均年齡為(57.22±16.36)歲，兩組差異有統計學意義(t=-5.70，P<0.001)。確診結核病患者中202例T-SPOT.TB檢測結果為陽性，平均年齡為(44.98±18.88)歲，NTM感染患者中49例T-SPOT.TB檢測結果為陽性，平均年齡為(53.61±18.43)歲，兩組差異有統計學意義(t=-2.63，P=0.009)。

討　　論

結核病診斷的金標準是病原學診斷陽性，即分枝桿菌培養陽性，菌種鑒定為結核分枝桿菌；但是，這種診斷方法在實際應用中存在重要缺陷：結核分枝桿菌培養耗時長，BACTEC MGIT 960培養需要6周，羅氏培養至少8周才能確定標本是否為陽性。因此，在缺乏細菌學診斷依據的情況下，醫生主要根據結核抗體產生及結核菌素皮膚試驗(TST)情況，結合病史、體征、影像學、血紅細胞沉降率等非特異性方法來進行結核病的臨床診斷。

表4　確診的結核病患者與NTM感染患者T-SPOT.TB檢測的抗原反應情況

注表中括號外數值為例數，括號內數值為“構成比(%)”

近年來，以檢測結核特異性抗原刺激下記憶性T細胞反應的T-SPOT.TB檢測成為臨床醫生進行結核病診斷，決定是否進行抗結核治療的重要輔助手段。由于T-SPOT.TB主要是發現結核感染者，其結果報告早于能確診結核病的結核分枝桿菌培養，但是其結果判讀受到多種因素的影響，采用T-SPOT.TB檢測方法診斷結核病的敏感度及特異度，不同研究報道差異較大。國外Sester等[1]對2009年1月至2011年11月間的844項研究進行了薈萃分析，結果顯示T-SPOT.TB對活動性結核病診斷的敏感度和特異度分別為81%(95%CI：75%～84%)和59%(95%CI：56%～62%)。國內資料顯示其敏感度和特異度變異較大，分別為82%～95%、65%～91%[2-6]。Lu等[7]在評估結核病診斷的Meta分析顯示，T-SPOT.TB檢測的敏感度為84.0%(95%CI：81.4%～86.4%)，特異度為65.8%(95%CI：62.1%～69.3%)。張昭勇等[8]對1994—2013年間的17篇中文文獻納入Meta分析，結果顯示γ干擾素釋放試驗(IGRA)診斷結核分枝桿菌感染的敏感度為86%(95%CI：85%～88%)，特異度為86%(95%CI：83%～88%)。中華醫學會結核病學分會總結國內IGRA檢測的研究數據，顯示敏感度和特異度差異較大，敏感度為53%～98%、特異度為60%～90%，但多數文獻報道的敏感度和特異度超過70%，提示均優于TST和結核抗體檢測(TB-Ab)[9]。因此，筆者對結核病患者從臨床診斷、隨訪診治排除不支持原診斷方案的不同診斷依據的人群進行分層，對基于T-SPOT.TB檢測結果診斷結核病的影響因素進行了回顧性分析。

一、診斷標準不同，T-SPOT.TB檢測的敏感度及特異度發生變化

臨床診斷結核病組與非結核病組T-SPOT.TB檢測的敏感度為81.97%、特異度為53.44%。經隨訪結核病組剔除培養證實為NTM感染及非結核病組剔除尚不能排除結核病的患者后，T-SPOT.TB檢測的敏感度及特異度略有提高，分別為83.77%及54.43%，敏感度與國內外報道基本一致，而特異度低于相關報道。我院為肺部?？萍敖Y核病定點醫院，與結核病相關疾病的鑒別診斷相對較多，尤其是NTM患者占到非結核病組的23.54%(93/395)，可能為本研究特異度較低的原因之一。

二、既往結核病史及體內存在陳舊性結核病灶影響T-SPOT.TB檢測特異度

395例非結核病組患者中，既往有結核病史及檢查發現肺部存在陳舊性結核病灶者T-SPOT.TB檢測陽性率明顯高于無此表現者(69.15%和38.21%)，表明與結核病相關的病史及肺部表現降低了T-SPOT.TB診斷結核病的特異度。

三、NTM感染致臨床診斷結核病組T-SPOT.TB檢測敏感度下降

抗酸染色陽性的臨床診斷結核病組T-SPOT.TB檢測陽性率為82.03%，剔除NTM感染患者后，結核病組T-SPOT.TB檢測陽性率上升至90.73%，差異有統計學意義。由于抗酸染色也呈陽性反應的NTM感染患者在臨床特征、影像學改變，甚至病理變化上難以與結核病鑒別，在沒有細菌學依據的情況下不能得到明確診斷，NTM病患者混于結核病患者之中[12]，可能是導致抗酸染色陽性患者T-SPOT.TB檢測陽性率降低的原因。在筆者的進一步分析中，93例確診的NTM感染患者的T-SPOT.TB檢測結果在陽性率、斑點數和患者平均年齡等方面與229例確診的結核病患者差異均有統計學意義，提示54歲[49例NTM感染患者T-SPOT.TB檢測結果為陽性，平均年齡為(53.61±18.43)歲]及以上的中老年患者，在T-SPOT.TB檢測結果為陽性，但斑點數較低時，應同時考慮NTM感染的可能。由于本研究中NTM感染患者例數相對較少，對于將T-SPOT.TB檢測用于結核病的輔助診斷中，NTM感染對檢測結果的影響程度還需進一步擴大患者例數進行研究。

四、年齡對T-SPOT.TB反應性的影響

臨床診斷結核病組T-SPOT.TB檢測陽性(950例)與檢測陰性(209例)患者之間的年齡差異在剔除含不支持因素的患者后變為無統計學意義，提示臨床診斷結核病組T-SPOT.TB檢測陰性的患者平均年齡較高可能是由于混雜了NTM感染等患者導致的。

臨床診斷結核病組(1159例)和經培養確診的結核病患者(229例)分別按年齡分段后，各年齡段T-SPOT.TB檢測陽性率之間差異均無統計學意義，進一步提示年齡對T-SPOT.TB的反應性并無影響。但是，由于本研究中，青少年(≤18歲)及老年(≥65歲)患者例數相對較少，有關年齡對T-SPOT.TB反應性是否存在影響的結論還需在進一步擴大樣本量后才能得出。

五、T-SPOT.TB反應性與結核分枝桿菌載量的相關性

本研究結果顯示，在T-SPOT.TB檢測陽性的患者中，斑點數值在結核病組(1074例)與非結核病組(385例)之間差異有統計學意義，斑點數越多患結核病的可能性越大。

而在結核病組，抗酸染色陽性患者T-SPOT.TB檢測陽性率(90.73%)明顯高于抗酸染色陰性患者(81.64%)，而且涂片陽性患者反應斑點數明顯高于陰性者，隨著結核病患者痰菌數量的增加而呈上升的趨勢，與之前學者的報道一致[13]。

六、患者結核病灶發生部位不同，行T-SPOT.TB檢測的結果也存在差異

在肺結核與肺外結核患者中，不同的研究對T-SPOT.TB反應性存在不同觀點，王立紅等[14]報道肺內外結核T-SPOT.TB反應細胞數量差異無統計學意義，而魯曦等[15]研究顯示IGRA在結核性胸膜炎患者的陽性率低于淋巴結結核。Fan等[16]對總共包含1711例患者的20個國內外研究進行了Meta分析，結果顯示T-SPOT.TB檢測對肺外結核診斷的敏感度為90%(95%CI：86%～93%)，明顯高于TST的63%(95%CI：54%～72%)；特異度為68%(95%CI：64%～73%)，與TST大致相同(71%；95%CI：60%～75%)。本研究顯示，以淋巴結結核、多組織器官結核、肺結核T-SPOT.TB檢測陽性率最高(均超過86%)，結核性胸膜炎次之(74.77%)，其他肺外結核相對較低(均在60%以下)。由于肺外結核的診斷在缺少細菌學依據的情況下常需要依靠病理學依據，除淺表病灶外，病理標本的獲取常創傷較大，患者及家屬難以接受，因此本研究結果提示相對于結核病其他檢查方法，外周血T-SPOT.TB檢測具有較高的敏感度，可以作為淋巴結結核、多組織器官結核、結核性胸膜炎等肺外結核輔助診斷及診斷性治療的重要依據。

綜上所述，T-SPOT.TB檢測活動性結核病的敏感度及特異度因臨床診斷、抗酸染色及培養結果、結核病灶部位不同而存在差異，同時還受既往結核病史或陳舊性結核病灶、NTM感染的影響。因此，T-SPOT.TB檢測指導結核病診斷時需謹慎解釋，綜合分析其臨床價值。

[1] Sester M, Sotgiu G, Lange C, et al. Interferon-γ release assays for the diagnosis of active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J, 2011, 37(1):100-111.

[2] 段靜,王艷,袁杭,等.結核桿菌五種實驗室檢測方法比較.現代檢驗醫學雜志,2014,29(4):79-82.

[3] 李紅,唐神結,史祥,等.全血γ-干擾素釋放試驗對涂陰肺結核診斷價值的研究.中華臨床醫師雜志(電子版),2012,6(16):4894-4897.

[4] 劉紅,黃永杰,王靜,等.結核感染T細胞斑點試驗在疑似結核病患者診斷中的價值研究.中華結核和呼吸雜志,2014,37(3):192-196.

[5] 潘麗萍,賈紅彥,劉菲,等. γ-干擾素釋放試驗對不同年齡組疑似肺結核的輔助診斷價值.中華結核和呼吸雜志,2015,38(12):892-896.

[6] 高萬芹.結核感染T細胞斑點實驗在結核病快速診斷中的臨床應用價值.國際檢驗醫學雜志,2014,35(24):3450-3452.

[7] Lu P, Chen X, Zhu LM, et al. Interferon-gamma release assays for the diagnosis of tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Lung, 2016, 194(3): 447-458.

[8] 張昭勇,張吉才,呂軍,等. γ-干擾素釋放試驗診斷結核分枝桿菌感染相關研究meta分析.臨床誤診誤治,2014,27(6):41-44.

[9] 中華醫學會結核病學分會,《中華結核和呼吸雜志》編輯委員會.γ-干擾素釋放試驗在中國應用的建議.中華結核和呼吸雜志,2014,37(10):744-747.

[10] 中華醫學會. 臨床診療指南：結核病分冊. 北京：人民衛生出版社，2005.

[11] 中國防癆協會基礎專業委員會. 結核病診斷實驗室檢驗規程. 北京：中國教育文化出版社，2006.

[12] Wu J, Zhang Y, Li J, et al. Increase in nontuberculous mycobacteria isolated in Shanghai, China: results from a population-based study. PLoS One, 2014, 9(10): e109736.

[13] 賈文青，劉瑩. 結核感染T細胞斑點試驗對結核病診斷的研究進展. 國際檢驗醫學雜志，2016，37(11)：1519-1522.

[14] 王立紅,付秀華,張桂芝，等. 結核感染T細胞斑點試驗在結核病診斷中的應用價值.中國防癆雜志,2013,35(12):992-996.

[15] 魯曦,李王平,謝永宏,等. γ-干擾素釋放試驗在肺外結核診斷中的應用與評價.中華肺部疾病雜志(電子版),2016,9(1):20-25.

[16] Fan L, Chen Z, Hao XH, et al. Interferon-gamma release assays for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. FEMS Immunol Med Microbiol, 2012, 65(3): 456-466.