一株產耐高溫β-甘露聚糖酶菌株的篩選鑒定

羅長財，繆靜，李國瑩，杜瑤，余曉斌

1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；

2.魯東大學 生命科學學院，山東 煙臺 264025

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）廣泛存在于動物、植物及微生物中，是一種能降解β-1，4-甘露糖苷鍵的水解酶，可應用于飼料、食品加工、生物能源、紡織、造紙、石油開采等領域[1-2]。

采用微生物生產β-甘露聚糖酶，具有表達量高、易于工業化發酵生產及后處理、生產成本相對低廉等特點，因而成為β-甘露聚糖酶工業化生產的主要方式[3]。目前已有來源于黑曲霉（Asper?gillus niger）[4]、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）[5]、費氏新薩托菌（Neosartorya fischeri）[6]、硫色曲霉（A.sulphureus）[7]、熱桿梭菌（Clostridium thermocel?lum）[8]等菌種的β-甘露聚糖酶獲得表達及應用。

β-甘露聚糖酶在工業化應用時，經常會涉及到高溫處理過程，而導致酶失活。因此，為滿足各種工業應用要求，提高β-甘露聚糖酶的耐高溫性能一直是急需解決的問題。

近年來，一些極端環境下生長的微生物被分離、篩選出來，如從海底火山口的硫磺礦區分離出來的極端鐵代謝嗜熱菌Pyrodictium abyssi，可在80～110℃范圍內生長[9]。這些可耐受極端環境的微生物蘊藏著豐富的酶基因資源[10]，因此，尋找產β-甘露聚糖酶的嗜熱菌，就成為開發耐高溫β-甘露聚糖酶的有效途徑。

我們從熱泉（水溫高于68℃）中分離、篩選出一株產β-甘露聚糖酶的極端嗜熱細菌。在本研究中，我們采用多種方法鑒定出該菌為一種極端嗜熱的枯草芽胞桿菌。另外，通過對該菌所產β-甘露聚糖酶進行測試，發現其耐高溫性能良好。

1 材料與方法

1.1 材料

槐豆膠（G0573）購自Sigma-Aldrich公司；酵母粉、胰蛋白胨購自Oxoid公司；魔芋精粉購自湖北強森魔芋科技有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。

富集培養基：胰蛋白胨1.5 g/L，酵母粉1 g/ L，氯化鈉1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KCl 0.5 g/ L，KH2PO40.5 g/L，FeCl31 g/L，CaCl20.23 g/L，（NH4）2SO41 g/L，pH7.0。

LB瓊脂篩選固體培養基[11]：胰蛋白胨10 g/ L，酶母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，槐豆膠6 g/L，剛果紅5 g/L，瓊脂粉20 g/L。

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酶母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉20 g/L（LB液體培養基不含瓊脂）。

發酵培養基：磨芋精粉20 g/L，（NH4）2SO410 g/L，NaNO35 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，KH2PO41.5 g/L。

恒溫恒濕培養箱、恒溫搖床（上海一恒科學儀器有限公司）；紫外-可見光分光光度計（島津公司）；梯度PCR擴增儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；高速冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；精密pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 菌體富集培養及篩選

將取自熱泉（位于江西省撫州市境內，水溫高于68℃）出水口處的水樣及泥沙樣本于無菌條件下分別接入富集培養基中，60℃、200 r/min培養24 h，取培養物涂布LB瓊脂篩選固體培養基，于42℃培養箱中靜置培養48 h。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態觀察 將篩選出的單菌落于LB固體培養基上劃線培養，培養2 d后觀察菌落特征，并送江南大學分析測試中心進行電鏡檢測。

1.3.2 生理生化培養鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12]及《微生物學實驗手冊》[13]中的鑒定方法，對篩選出的產β-甘露聚糖酶菌種進行生理生化檢測，初步完成菌種鑒定。

1.3.3 16S rDNA鑒定 采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，提取所篩選菌株的基因組DNA，利用通用引物27F（AGAGTTTGATCCTCGC TCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）進行PCR擴增（94℃預變性3 min；94℃變性60 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30個循環；72℃延伸10 min），獲得目標菌株的16S rDNA。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，送上海生工公司測序，所測定的16S rDNA序列通過NCBI進行比對，尋找同源性高的序列，再利用MEGA5.2軟件繪制出該菌株的系統發育樹。

1.4 菌體在不同溫度、pH值下的生長測試

在30～85℃及不同pH值條件下，分別采用LB液體培養基以200 r/min培養24 h，8000×g離心10 min，菌體于120℃烘干至恒重，檢測不同條件下的菌體生長量。根據菌體量以確定該菌株在不同條件下的生長狀況。

1.5 菌株發酵及酶液制備

分離、篩選獲得的菌株在500 mL三角瓶中進行發酵產酶培養，初始裝液量為100 mL，初始pH7.0，溫度50℃，轉速200 r/min，發酵36 h。發酵結束后，8000×g下離心10 min，對上清液進行后續檢測。將該菌株所產的β-甘露聚糖酶命名為BS-Man。

1.6 甘露聚糖酶活力測定

1.6.1 測定方法 采用DNS法檢測β-甘露聚糖酶酶活。用0.1 mol/L、pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋酶液及配制反應底物（6 g/L槐豆膠），吸取2.0 mL經37℃預熱的待測酶液至試管中，加入2.0 mL經37℃預熱的底物溶液，振蕩，37℃精確水浴30 min，然后加入5.0 mL DNS試劑，振蕩混勻，以終止酶解反應。整個反應體系在沸水中加熱5 min后，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25.0 mL，振蕩混勻。以標準空白樣作為空白對照，測定D540nm值，通過標準曲線計算相應的酶活。1.6.2 酶活定義 在37℃、pH5.5的條件下，每分鐘從3 mg/mL甘露聚糖溶液中水解釋放1 μmol還原糖所需酶量為一個酶活單位（U）。

1.7 BS-Man的最適反應pH值

分別添加等量的BS-Man酶液，在37℃、不同pH值（1.5～10）條件下反應30 min（pH1.5～5.0：磷酸氫二鈉-鹽酸緩沖液；pH5.0～8.5：磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液；pH8.5～10.0：甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液），測定不同pH值下的酶活性，以所測得最高酶活性為100%，其余不同pH值條件下所測酶活力與之相比，得到該酶在不同pH值下的相對酶活，從而確定其最適pH值。

1.8 BS-Man的最適反應溫度及耐熱性能測試

在最適pH值條件下，于不同溫度（30～80℃）反應30 min，設定最高酶活為100%，其余反應溫度下所測出的酶活力與之相對比，獲得各反應溫度下的相對酶活，以確定該酶的最適反應溫度。

另外，為確定該酶的耐高溫性能，在相同條件下，各組取等量酶液在不同溫度（60～90℃）預處理不同時間，以未經熱處理的酶液酶活力為100%，各處理組與之相比，獲得該酶經不同溫度處理后的剩余相對酶活，確定其耐高溫性能。

2 結果

2.1 產β-甘露聚糖酶的菌株篩選

對富集培養后的培養產物，采用添加魔芋精粉及剛果紅的LB固體篩選培養基進行菌種篩選，結果如圖1，在LB固體培養基上生長出的菌落呈白色，表面粗糙不規則，有隆起、皺褶。所挑選菌落的水解透明圈與菌落大小見表1，根據H/C比值，選取2號菌落進行后續鑒定，并將該菌株命名為TBS2。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態觀察 TBS2在電鏡下的形態見圖2，該菌呈桿狀，可見內生孢子，無莢膜，長有鞭毛，符合芽孢桿菌的形態特征。

2.2.2 生理生化鑒定 TBS2的生理生化測試結果見表2，參照鑒定手冊，可以初步判定TBS2為芽胞桿菌屬菌株。

圖1 產β-甘露聚糖酶生產菌株篩選

圖2 TBS2在電鏡下的形態（10 000×）

表1 各菌落水解透明圈與菌落直徑

2.2.3 16S rDNA鑒定 以提取的TBS2基因組DNA為模板、27F和1492R為引物進行PCR擴增，獲

得一條約1.5 kb的條帶（圖3），測序結果表明該序列總長為1503 bp。在NCBI數據庫中進行BLAST比對，選取相似序列，采用MEGA5.2構建菌株的系統發育樹如圖4。可以看出，TBS2與枯草芽孢桿菌位于同一分支，同源性最高，達到99%。因此，結合以上菌體形態、生理生化特征，可以確定我們從熱泉中分離、篩選獲得的微生物為一種嗜熱枯草芽孢桿菌。

2.3 TBS2在不同溫度及pH值條件下的生長性能

圖3 TBS2的16S rDNA PCR產物分析M：DNA marker；1：PCR擴增產物

圖4 TBS2系統發育進化樹

表2 TBS2生理生化特征

將篩選出的嗜熱枯草芽胞桿菌TBS2，在不同溫度及pH值條件下，于LB液體培養基中進行生長培養。結果表明，TBS2可在35～80℃下生長，溫度低于35℃及高于85℃時均不生長，最適生長溫度為50℃。此外，該菌株可在pH4.0～9.0范圍內生長，最適生長pH值為6.0～7.0，該結果與段蕾等報道的枯草芽孢桿菌CD-3一致[14]。

2.4 BS-Man的最適pH值測定

由TBS2所產β-甘露聚糖酶BS-Man的反應pH值曲線（圖5）可以看出，BS-Man的最適反應pH值為6.0。

2.5 BS-Man的最適反應溫度及耐熱性能

由BS-Man的反應溫度曲線（圖6）可以看出，BS-Man的最適反應溫度為55℃。

BS-Man的耐熱性能曲線如圖7，在60～70℃處理不超過60 min時，酶活損失量很小，但隨著處理溫度及時間的增加，酶活損失加劇，但即使這樣，該酶在 90℃處理 10 min，剩余酶活仍達63.6%，這表明我們篩選出的菌株所產β-甘露聚糖酶具有良好的耐高溫性能。

3 討論

圖5 BS-Man的反應pH值曲線

圖6 BS-Man的反應溫度曲線

圖7 BS-Man在不同溫度下的耐熱性能

β-甘露聚糖酶應用廣泛，但在很多領域內應用時須具有良好的耐高溫能力。如飼料制粒時，通常要求在85℃以上處理3 min左右，一般的酶在這種條件下極易完全變性，從而失去效果。因此，作為一種合格的飼料用酶，要求所開發的β-甘露聚糖酶至少能耐受85℃以上的高溫。

目前已開發出的β-甘露聚糖酶的耐高溫性能普遍不高，難以滿足現有工農業生產需求，因此，開發出一種具有優良耐高溫性能的β-甘露聚糖酶具有良好的市場應用前景。

為提高β-甘露聚糖酶的耐高溫性能，有人嘗試過采用定點突變、添加保護劑或在酶蛋白表面進行物理包被等方法，以改變酶蛋白的空間結構，或避免酶蛋白與熱氣直接接觸來提高其耐高溫性能[15-16]，但所取得的效果并不理想。

極端環境下生長的微生物，如極端嗜熱、極端嗜鹽等微生物，往往有極強的耐受能力，具有優異而特殊的基因資源。因此，這些微生物成為目前生物資源開發的一大寶庫。至2001年，已有60多種極端微生物被發現并利用[17]。通常，極端嗜熱的微生物所產生的酶往往具有極高的熱穩定性、pH值穩定性和耐受化學或物理變性劑的優良特性，如耐高溫α-淀粉酶、DNA聚合酶等的開發即是非常有代表性的例子。因此，從環境中直接篩選極端嗜熱微生物，通過分子生物學技術克隆相關基因，進一步進行相應的優化、改造，并選擇合適的表達系統高效表達，是耐高溫酶制劑開發的一個發展方向，更具有可行性和可操作性，可產生巨大的工業化生產、應用價值。

在本研究中，我們從熱泉中分離、篩選出一株極端嗜熱的枯草芽孢桿菌TBS2，該菌所產的耐高溫β-甘露聚糖酶具有良好的耐高溫性能，這為我們后續的重組耐高溫β-甘露聚糖酶的開發及應用奠定了堅實的基礎。

[1] Chauhan P S,Puri N,Sharma P,et al.Mannanases: microbial sources,production,properties and potential biotechnological applications[J].Appl Microbiol Biotech?nol,2012,93(5):1817-1830.

[2] Malherbe A R,Rose S H,Viljoen-Bloom M,et al. Expression and evaluation of enzymes required for the hydrolysis of galactomannan[J].J Ind Microbiol Bio?technol,2014,41(18):1201-1209.

[3] Luo H,Wang Y,Wang H,et al.A novel highly acid?ic beta-mannanase from the acidophilic fungus Bispo?ra sp.MEY-1:gene cloning and overexpression in Pi?chia pastoris[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,82(3): 453-461.

[4] Yu S,Li Z,Wang Y,et al.High-level expression and characterization of a thermophilic β-mannanase from Aspergillus niger in Pichia pastoris[J].Biotechnol Lett,2015,37(9):1853-1859.

[5] Vu T T,Quyen D T,Dao T T,et al.Cloning,highlevel expression,purification and properitie of a novel endo-beta-1,4-mannanase from Bacillus subtilis G1 in Pichia pastoris[J].J Microbiol Biotechnol,2012,22 (3):331-338.

[6] Yang H,Shi P,Lu H,et al.A thermophilic β-man?nanase from Neosartorya fischeri P1 with broad pH stabilityand significanthydrolysisability ofvarious mannan polymers[J].Food Chem,2015,173:283-289.

[7] Chen X L,Cao Y H,Ding W Q,et al.Cloning,func?tionalexpression and characterization ofAspergillus sulphureus β-mannanase in Pichia pastoris[J].J Bio?technol,2007,128(3):452-461.

[8] Ghosh A,Verma A K,Gautam S,et al.Structure and functional investigation of ligand binding by a family 35 carbohydrate binding module(CtCBM35)of β-man?nanase of family 26 glycoside hydrolase from clostridi?um thermocellum[J].Biochemistry(Moscow),2014,79(7): 672-686.

[9] Rieger G,Rachel R,Hermann R,et al.Ultrastructure of the hyperthermophilic archaeon Pyrodictium abyssi [J].J Struct Biol,1995,115:78-87.

[10]Leuschner C,Antranikian G.Heatstable enzymes from extremely thermophilic and hyperthermophilic microor?ganisms[J].World J Microbiol Biotechnol,1995,11(1): 95-114.

[11]Downie B,Hilhorst H W M,Bewley J D.A new as?say for quantifying endo-β-D-mannanase activity us?ing congored dye[J].Phytochemistry,1994,36(4):829-835．

[12]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[13]周德慶.微生物實驗手冊[M].上海:上海科學技術出版社,1986.

[14]段蕾,高潤池,許波,等.β-甘露聚糖酶產生菌的分離·鑒定及酶學特性研究[J].安徽農業科學,2008,36(24): 10311-10314.

[15]Zhou Haiyan,Yang Wenjiao,Tian Yun,et al.N-termi?nal truncation contributed to increasing thermal stabili?ty of mannanase Man1312 without activity loss[J].J Sci Food Agric,2016,96(4):1390-1395.

[16]劉朝輝,武偉娜,劉躍,等.保護劑提高β-甘露聚糖酶熱穩定性的研究[J].天津大學學報,2008,41(1):114-118.

[17]唐雪明,王正祥,諸葛健.具有工業應用價值的高熱穩定性極端酶[J].食品與發酵工業,2001,27(5):65-70.