LC-MS/MS法測定大鼠血漿中5-羥基-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮濃度

李備，周穎，常秀亭，羅小菊，云永歡，曹獻英

1.海南省食品檢驗檢測中心，海南 海口 570311；2.海南大學 食品學院，海南 海口 570228

中藥高良姜具有散寒止嘔、溫胃止痛的功效，二苯基庚烷類化合物是其重要的生物活性成分，在抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等方面表現出較好的藥理活性[1-5]。5-羥基-7-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮（DPHA）是高良姜中重要的二苯基庚烷類成分（結構式見圖1），具有上述活性[6-12]。本研究建立了測定大鼠血漿中DPHA濃度的LC-MS/MS方法，為高良姜二苯庚烷類成分的藥動學研究和開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD大鼠（10周齡，體重240±20 g）由長沙市天勤生物技術有限公司提供［動物合格證號：SCXK（湘）2014-0011］。

Prominence UFLC液相色譜儀（日本島津公司）通過Turbo V離子源接口串聯AB-SCIEX API 4000+串聯四級桿質譜儀，Analyst軟件控制數據采集和處理（美國AB公司）；5922型冷凍離心機（日本Kubota公司）；XS105DU十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LabTow?er EDI15超純水一體機（美國熱電公司）；Vibrax圓周振蕩器（德國艾卡公司）；FDB03DD氮吹儀（英國Techne公司）；色譜級甲醇（德國默克公司）；色譜級正己烷和甲酸（阿拉丁試劑）。

1.2 供試品溶液的制備

精密稱取DPHA對照品適量，加甲醇配制成0.1 mg/mL的儲備液，4℃保存備用。取益智酮甲對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成200 ng/mL內標溶液。

1.3 血漿樣品采集處理

大鼠經適應性飼養3 d，臨用前禁食不禁水12 h，從眼眶靜脈叢采集血液樣品，肝素鈉抗凝，4000 r/min離心10 min獲得血漿，取50 μL血漿樣品加入1 mL正己烷，2000 r/min振蕩混勻10 min，離心后分取正己烷層950 μL，37℃加熱氮氣吹干，加入50 μL甲醇（含內標益智酮甲200 ng/ mL）復溶，2000 r/min振蕩混勻3 min，13 000 r/ min離心10 min，取上清液置微量進樣管中，待進樣分析。

1.4 色譜-質譜條件

菲羅門Kinetex XB-C18色譜柱（2.10 mm×50 mm，2.6 μm），柱溫40℃，以水（含0.01%甲酸，A）-甲醇（含0.01%甲酸，B）為流動相梯度洗脫［梯度洗脫程序：0～0.50 min（1%B），0.51～6.50 min（60%～100%B），6.51～8.00 min（1%B），流速0.30 mL/min，進樣量10 μL］。電噴霧離子源（ESI），正離子檢測，噴霧電壓5500 V，GS1為55 psi，GS2為45 psi，簾氣為35 psi，噴霧溫度為500℃，碰撞氣為 10 psi。多反應離子監測（MRM），用于定量分析的離子對為m/z 329.2→163.0，內標化合物益智酮甲為313.1→137.0。

1.5 專屬性考察

取空白血漿、空白血漿加對照品和內標溶液、靜脈注射給藥后30 min血漿樣品，按1.3項下樣品處理方法處理，按1.4項下條件進樣分析。

1.6 線性關系考察

取0.1 mg/mL DPHA甲醇溶液適量，用空白血漿配制成2000 ng/mL血漿樣品，再用空白血漿逐級稀釋成1000、100、10、5、2、1 ng/mL的血漿樣品，經1.3項下方法處理后，進樣10 μL，按1.4項下方法進行分析。

圖1 5-羥基-7（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮

1.7 精密度和準確度考察

配制高、中、低3種濃度（1600、100、6 ng/mL）的DPHA血漿樣品，每個濃度設5個平行樣，經1.3項下方法處理后分別進樣分析，計算日內精密度和準確度，連續測定3 d，計算日間精密度。

1.8 基質效應和提取回收率試驗

按文獻方法[13-14]，采用提取后添加法評定基質效應，同時考察提取回收率。Set1：取高、中、低3種濃度DPHA對照品溶液50 μL，直接進樣分析，得到峰面積A1；Set2：取空白血漿50 μL，經2.3項下方法處理至氮氣37℃加熱吹干步驟，然后分別加入高、中、低3種濃度DPHA對照品溶液50 μL復溶，2000 r/min振蕩混勻3 min,13 000 r/min離心10 min，取上清液進樣分析，得到峰面積A2；Set3：配制高、中、低3種濃度DPHA血漿樣品，各取50 μL經1.3項下方法處理后進樣分析，得到峰面積A3。以上每個濃度設5個平行樣。基質效應ME=A2/A1×100%；提取回收率RE=A3/A2× 100%。

1.9 穩定性考察

配制高、中、低3種濃度的DPHA血漿樣品，每個濃度設5個平行樣，考察血漿樣品在室溫放置4 h、凍融循環3次和血漿樣品處理后置自動進樣器中8 h的穩定性，經1.3項下方法處理后分別進樣分析，計算樣品短期穩定性。

2 結果

2.1 專屬性考察結果

DPHA、益智酮甲出峰時間分別為3.91、4.90 min，分離度大于1.5，空白溶劑和基質對測定無干擾。色譜圖見圖2。

圖2 DPHA（1）和內標益智酮甲（2）色譜圖A：空白血漿；B：空白血漿加DPHA；C：空白血漿加內標；D：空白血漿加DPHA和內標；E：靜脈注射給藥30 min后血漿樣品

2.2 線性考察結果

以待測物與內標峰面積之比（y）為縱坐標、待測物濃度（x）為橫坐標、權重為1/x進行線性回歸，得回歸方程y=0.00119x+0.000409（r=0.9996），表明DPHA為1～2000 ng/mL時線性關系良好。

2.3 精密度和準確度考察結果

研究結果（表1）顯示，日內、日間精密度RSD均低于15%，重復性良好；準確度為105.03%～112.80%。

表1 DPHA定量分析精密度和準確度結果

2.4 基質效應和提取回收率試驗結果

結果（表2）表明，高、中、低3種濃度下，待測物均無顯著的基質效應，提取回收率大于70%。

表2 大鼠血漿中DPHA的基質效應和提取回收率（n=5）

2.5 穩定性考察結果

各濃度樣品測試的準確度為 102.46%～110.60%，小于15%；3種處理方式對樣品穩定性無明顯影響。結果見表3。

表3 血漿樣品中DPHA的穩定性

2.6 樣品測試

將上述分析方法用于分析大鼠給藥后血漿樣品。取4只SD大鼠，尾靜脈注射給予DPHA 1.0 mg/kg，0.5 h后經眼眶靜脈取血，按1.3項下方法處理后分別進樣分析，計算得血藥濃度為36.2±5.1 ng/mL（n=4，RSD=14.0%）。

3 討論

DPHA結構與姜黃素類似，一般而言姜黃素類似物溶解性、穩定性較差，應用液相色譜-質譜聯用技術分析這些化合物在血漿中的含量，文獻報道基質效應為43%～86%，對結果的準確性存在一定影響[14-15]。本研究建立的DPHA液相色譜-質譜分析方法，基質效應為99.63%～110.50%，方法的建立過程中，還考察優化了離子源噴霧電壓、GS1、GS2、簾氣、噴霧溫度等參數。對血漿樣品的處理，通過試驗對比了甲醇、乙腈沉淀和乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚萃取，最后確定正己烷萃取處理后檢測干擾少、提取率高。同時設定了3對 離 子 對（329.2→163.0、329.2→137.0、392.2→311.0）檢測分析DPHA，其中392.2→311.0信號最強，但干擾峰較多，最后選擇信號稍弱而干擾較少的329.2→163.0作為定量分析的離子對。以上結果為DPHA的藥代動力學研究奠定了基礎，也為相關藥效藥理研究的給藥劑量提供了參考。

[1] Matsuda H,Ando S,Kato T,et al.Inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum on production of nitric oxide in lipopolysaccharide-activated macro?phages and the structural requirements of diarylhep?tanoids for the activity[J].Bioorgan Med Chem,2006, 14(1):138-142.

[2] Lee H J,Kim J S,Ryu J H.Suppression of induc?ible nitric oxide synthase expression by diarylhep?tanoids from Alpinia officinarum[J].Planta Med,2006, 72(1):68-71.

[3] 沈健,張虎翼,徐波,等.高良姜中的抗氧化有效成分[J].天然產物研究與開發,1998,10(2):33-36.

[4] Matsuda H,Nakashima S,Oda Y,et al.Melanogene?sis inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum in B16 melanoma cells[J].Bioorgan Med Chem,2009, 17(16):6048-6053.

[5] 安寧.常用中藥高良姜化學成分研究[D].北京:中國協和醫科大學,2006.

[6] 鄧亦峰,馮麗娜,羅輝.辛辣組分對高良姜提取物抗菌活性的影響[J].食品研究與開發,2013,34(4):4-7.

[7] Zhang B B,Dai Y,Liao Z X,et al.Three new anti?bacterial active diarylheptanoids from Alpinia officina?rum[J].Fitoterapia,2010,81(7):948-952.

[8] Sawamura R,Sun Y,Yasukawa K,et al.Antiviral ac?tivities of diarylheptanoids against influenza virus in vitro[J].J Nat Med,2010,64:117-120.

[9] Konno K,Sawamura R,Sun Y,et al.Antiviral activi?ties of diarylheptanoids isolated from Alpinia officina?rum against respiratory syncytial virus,poliovirus,mea?sles virus,and herpes simplex virus type 1 in vitro [J].Nat Prod Commun,2011,6(12):1881-1884.

[10]Kiuchi F,Shibwa M,Sankawa U.Inhibitors of prosta?glandin biosythensis from Alpinia officinarum[J].Chem Pharm Bull,1982,30(6):2279-2282.

[11]Kiuchi F,Iwakami S,Shibuya M,et al.Inhibition of prostaglandin and leukotriene biosynthesis by gingerols and diarylheptanoids[J].Chem Pharm Bull,1992,40(2): 387-391.

[12]Yasukawa K,Sun Y,Kitanaka S,et al.Inhibitory ef?fect of the rhizomes of Alpinia officinarum on TPA-in? duced inflammation and tumor promotion in two-stage carcinogenesis in mouse skin[J].J Nat Med,2008,62 (3):374-378.

[13]Sun Y,Tabata K,Matsubara H,et al.New Cytotoxic diarylheptanoids from the rhizomes of Alpinia officina?rum[J].Planta Medica,2008,74(4):427-431.

[14]向平,沈敏,卓先義.液相色譜-質譜分析中的基質效應[J].分析測試學報,2009,28(6):753-756.

[15]Cao Y,Xu R X,Liu Z.A high-throughput quantifica?tion method ofcurcuminoidsand curcumin metabo?litesin human plasma viahigh-performanceliquid chromatography/tandem massspectrometry[J].JChro?matogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2014,949-950(4):70-78.