CXCL1促進內質網應激在肝癌腫瘤微環境中傳遞

彭雨蒙，陳偉，鄒嶺，葉甲舟，白濤，陳潔，陳健康，王翠，劉寧，楊曉莉，魏從文，鐘輝，吳飛翔，5

1.廣西醫科大學 附屬腫瘤醫院肝膽外科，廣西 南寧 530021；2.湘南學院 附屬醫院，湖南 郴州 423000；3.中國人民武裝警察部隊總醫院 檢驗科，北京 100039；4.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100850；5.廣西肝癌診療工程技術研究中心，廣西 南寧 530021

腫瘤細胞及其相關巨噬細胞等組成的腫瘤微環境與腫瘤從良性轉化為惡性密切相關，促進腫瘤在沒有生長因子條件下的存活，調控細胞免疫促進腫瘤自身的生長和轉移[1-2]。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指腫瘤微環境中的各種因素導致內質網中蛋白超負荷或折疊受阻，從而使內質網中未折疊的蛋白堆積[3]。ERS發生時，癌細胞常通過激活未折疊蛋白反應（unfolded protein reaction，UPR）3個相關信號通路IRE1、ATF6、PERK增加蛋白折疊，減少未折疊蛋白的合成，恢復內環境穩態，但當蛋白質錯誤折疊持續發生，誘導了持久且程度嚴重的ERS，UPR就會變成促進凋亡的通路[4-5]。近年來的研究表明，ERS不僅可通過腫瘤細胞間的相互激活UPR通路促進腫瘤細胞對ERS的耐受，同時可通過與巨噬細胞間相互作用促進腫瘤生長[6]。我們前期通過衣霉素（tunicamycin，TM）刺激人肝癌HepG2細胞誘導肝癌細胞發生ERS后，上清中趨化因子1（CXC chemokine ligand 1，CXCL1）的表達量顯著高于趨化因子家族的其他成員，但在ERS的條件下，CXCL1對于微環境中肝癌細胞及肝癌相關巨噬細胞的作用尚不明確。在本研究中，我們收集發生ERS的人肝癌HepG2細胞上清，作用于未發生ERS的HepG2細胞和分化成熟的巨噬細胞（THP-1），探究CXCL1在ERS條件下對肝癌微環境中肝癌細胞和腫瘤相關巨噬細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1、HepG2細胞（軍事醫學研究院生物工程所鐘輝課題組惠贈）；DMEM培養基、1640培養基、胎牛血清（Gibco公司）；轉染試劑VigoFect（Qbiogene公司）；衣霉素、丙二醇甲醚醋酸酯（TPA）、DMSO、人CXCL1 ELISA試劑盒（Sigma-Aldrich公司）；TRNzol-A+總RNA提取試劑盒、Su?perReal熒光定量預混試劑彩色版（SYBR Green）（天根生化科技有限公司）；TransScript Frist-Strand cDNA Synthesis試劑盒（全式金生物技術公司）；jetPRIMEin vitroDNA&siRNA transfec?tion reagent（Polyplus公司）。

1.2 細胞培養

HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基常規培養。THP-1細胞用含10%胎牛血清的1640培養基中培養，加入終濃度為200 U/mL的青、鏈霉素，當細胞長至密度為5×107/皿時，用0.1%TPA分2次誘導48 h，使THP-1分化為成熟巨噬細胞用于后續實驗。

1.3 建立ERS時肝癌微環境中細胞間傳遞模型

收集條件培養基建立不同細胞間ERS傳遞模型[6]。HepG2細胞長至70%時，換成含10%胎牛血清的新鮮DMEM培養基，分別按未處理、5 mmol/mL DMSO和5 mmol/mL TM處理細胞12 h后換成新鮮培養基，再培養24 h收集培養基，離心后分別加入誘導成熟的THP-1和HepG2細胞中，分別培養12和24 h后收集細胞提取mRNA，實時熒光定量PCR檢測HepG2和THP-1細胞IRE1、PERK、ATF6的mRNA表達情況。

1.4 ELISA檢測培養基中的CXCL1含量

按照人CXCL1 ELISA試劑盒說明書檢測培養基中的CXCL1含量。收集TM刺激后的條件培養基，離心后分別與標準樣加入樣板中，室溫孵育1 h，洗板3次后，加入100 μL鏈霉親和素-HRP工作液，室溫孵育20 min，再次洗板3次后，TMB顯色，終止液終止反應，酶標儀檢測，計算CXCL1的含量。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

TRIzol法提取各組細胞RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。SYBR Green染料法進行實時熒光定量PCR反應，擴增引物見表1，以β-actin為內參照。反應條件：95℃ 15 min，95℃10 s，根據不同目的基因60～66℃延伸30 s。

1.6 敲低HepG2細胞中CXCL1表達

合成siRNA-CXCL1序列（正義鏈：5'-CACCC AAACCGAAGUCAUAGCCA-3'；反義鏈：5'-UGGC UAUGACUUCGGUUUGGGUG-3'）。當HepG2細胞長至40%～50%時可用于轉染。將2 μg質粒與100 μL生理鹽水混勻，靜置5 min，再將2 μL VigoFect與100 μL生理鹽水混勻，將以上兩者輕輕混合，室溫靜置15 min后加到培養基中；為提高敲低效率，于轉染24 h后按上述步驟再轉染一次；對照組轉染空載體質粒；48 h后收集培養液及細胞，RT-PCR檢測轉染效率，ELISA檢測上清中CXCL1的表達情況。

1.7 收集CXCL1敲低的條件培養基用于培養HepG2和TPH-1細胞

當CXCL1敲低的HepG2細胞長至70%時，換成含10%胎牛血清的新鮮DMEM培養基，再分未處理組、5 mmol/mL DMSO組、5 mmol/mL TM組，刺激12 h后換成新鮮培養基，再培養24 h收集培養基，離心后分別加到誘導成熟的THP-1和HepG2細胞中，分別培養12和24 h后收集細胞提取mRNA，RT-PCR檢測HepG2和THP-1細胞IRE1、PERK、ATF6的mRNA表達情況。

1.8 數據分析處理

計量資料采用x±s表示，組間比較采用t檢驗，利用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 構建ERS在細胞間傳遞的模型

收集TM刺激HepG2細胞后的條件培養基培養HepG2和TPH-1細胞12和24 h后，熒光定量PCR檢測4組細胞中UPR相關IRE1、PERK、ATF6的mRNA水平。結果提示，2種細胞中3種蛋白的mRNA水平均較空白對照和DMSO對照組升高（圖1、2）。

圖1 ERS條件培養基刺激人肝癌HepG2細胞后UPR相關蛋白mRNA的表達

2.2 檢測si-CXCL1的敲低效率

轉染si-CXCL1敲低HepG2細胞的CXCL1水平，RT-PCR技術檢測敲低效率，ELISA檢測其培養基中分泌的CXCL1含量。結果顯示，與對照組相比，si-CXCL的敲低效率達67.89%（圖3），敲低后HepG2細胞分泌到培養基中的CXCL1也明顯減少（P＜0.05）（圖4）。

圖2 ERS條件培養基刺激人巨噬細胞THP-1后UPR相關蛋白mRNA的表達

圖3 RT-PCR檢測si-CXCL1對293T細胞中CXCL1的敲低效率

圖4 ELISA檢測si-CXCL1敲低293T細胞后培養基中CXCL1濃度

2.3 敲低CXCL1后對ERS在細胞間傳遞的影響

收集TM刺激后si-CXCL1的HepG2細胞的上清，離心后分別用于培養HepG2和TPH-1細胞，分別于12和24 h通過熒光定量PCR檢測4組細胞中UPR相關IRE1、PERK、ATF6的mRNA水平。結果提示，HepG2和THP-1細胞中IRE1、PERK、ATF6的mRNA水平均較空白對照和DMSO對照組降低（圖5、6）。

圖5 CXCL1敲低的ERS條件培養基刺激人肝癌HepG2細胞后UPR相關蛋白的mRNA表達

圖6 CXCL1敲低的ERS條件培養基刺激人巨噬細胞THP-1后UPR相關蛋白的mRNA表達

3 討論

肝癌是在慢性乙型肝炎肝硬化基礎上發展而來的腫瘤，ERS貫穿肝癌發生發展的始終[7]。ERS在不同細胞之間的傳遞，一方面激活腫瘤微環境中的免疫細胞以及內皮細胞中多種信號通路；另一方面激活腫瘤相關巨噬細胞分泌多種炎癥因子，影響腫瘤微環境，促進腫瘤相關巨噬細胞由M1型向M2型轉化，從而參與腫瘤的發生發展[8-10]。為了探討細胞間的相互作用，我們首先收集了ERS時的條件培養基，建立了ERS時細胞間傳遞的模型，用于后續研究。

趨化因子是炎癥刺激下由腫瘤細胞和腫瘤基質細胞分泌的細胞因子，它們一方面通過募集其他免疫細胞促進腫瘤免疫，另一方面導致慢性炎癥并促進腫瘤的增殖、侵襲、轉移、血管形成并抑制細胞凋亡[11]。研究表明，CXCL1在包括肝癌在內的大部分腫瘤中高表達，這種高表達與腫瘤預后較差密切相關。雖然在肝癌中CXCL1可通過CXCR2-CXCL1軸[12]和CXCL/NF-κB正反饋[13]調控肝癌的發生發展，然而CXCL1在肝癌ERS中的作用研究較少。Lee等[14]通過Tg誘導HepG2細胞發生ERS時，CXCL1的表達增加，而腫瘤微環境中的免疫細胞下調，提示CXCL1可能在ERS中介導細胞間的相互作用。本研究建立的細胞間傳遞模型，顯示在微環境中的ERS可通過CXCL1同時在腫瘤細胞間和腫瘤細胞與分化成熟的巨噬細胞間傳遞。

UPR是ERS發生后細胞為應對壓力、維持內環境穩態做出的反應。UPR通過激活細胞膜上的IRE1、ATF6、PERK促進蛋白折疊，然而ATF6上調也可上調壞死因子CHOP蛋白的表達,促進腫瘤壞死[15]。在多數腫瘤中，UPR通路呈一條或多條激活狀態，UPR中不同通路的激活對腫瘤患者預后受益作用往往不同[16]。Kim等[17]研究肺癌時發現，GRP78和CHOP通路激活，患者總體生存降低；而Hetz等[18]通過基因組UPR靶基因指數系統研究雌激素受體α（ERα）陽性乳腺癌患者，發現UPR的3條通路均激活，且激活的UPR通路與患者不良預后密切相關。在本研究中，用條件培養基培養HepG2和分化成熟的THP-1細胞時，UPR的3條通路表達均增加，且同Hetz等研究乳腺癌時UPR的3條通路均被激活導致患者不良預后類似。前期研究表明CXCL1的增加與肝癌的不良預后密切相關，而當下調HepG2細胞中的CXCL1表達后，UPR通路中的PERK、IRE、ATF6均較對照組降低，表明ERS可通過CXCL1在細胞間傳遞，介導肝癌的發生發展。然而我們還注意到，THP-1細胞中的UPR蛋白與HepG2細胞中的UPR蛋白在CXCL1變化時二者的變化趨勢一致。通常來說包括CXCL1在內的趨化因子表達升高可促進巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，本研究中，CXCL1增加時，ERS相關蛋白mRNA水平也增加，這種增加是否有助于促進具有吞噬作用的M1型巨噬細胞向促進腫瘤生長的M2型巨噬細胞轉化，有待更多研究[8]。

本研究表明，肝癌腫瘤微環境中細胞間ERS可通過CXCL1進行傳遞，這種細胞間傳遞作用可引起UPR相關蛋白的表達變化，進而影響肝癌的發生發展。

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