重金屬鎘通過DNA氧化損傷途徑誘導細胞中心體擴增

張瑞凱，張艷花，劉琴琴，楊華麗，李少欽

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

隨著工業化和城市化的發展，重金屬污染因其高毒性、普遍性和持久性的存在，成為影響生態系統中有機體代謝的重要環境問題[1]。通常密度超過5 g/cm3的金屬被稱為重金屬，其中鉛（Pb）、鎘（Cd）、汞（Hg）、鉻（Cr）和砷（As）廣泛存在于環境中，是威脅人體健康的主要的有毒重金屬[1]。鎘是天然存在的重金屬之一，在工業生產中經常使用，被國際癌癥研究機構（IARC）歸為Ⅰ類致癌物[2-4]。鎘暴露的主要來源是食品、香煙煙霧及鎘相關工業。鎘具有很長的生物半衰期，容易導致毒性累積，產生致癌作用[5]。

癌癥是最常見的無傳染性疾病，其致死率處于領先地位。根據2017年2月世界衛生組織（WHO）更新的數據，2012年約有1400萬新增癌癥病例，2015年約有880萬的死亡病例和癌癥有關。已明確，長期暴露在鎘環境下會增加癌癥的發生率[6-7]，但鎘導致癌癥的機制尚不清楚[8-9]。中心體擴增指的是在一個細胞中出現超過2個中心體。已有報道稱中心體擴增在癌癥發生過程中扮演重要角色[10-13]，中心體擴增能把非腫瘤細胞轉化為腫瘤細胞[10]，轉基因誘發中心體擴增的小鼠會自發產生腫瘤[14]。有研究證明重金屬也會引起中心體擴增[15]。目前還不清楚鎘是否會引起中心體擴增，如是，那么中心體擴增就可能是鎘誘發腫瘤的生物學機理。

許多研究發現，重金屬鎘能夠引發活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生[4,16-21]和細胞內的DNA損傷[22]。但是，并不清楚鎘是否通過升高ROS而引起DNA的氧化損傷。由于ROS和DNA損傷都與中心體擴增有關[23]，我們假設鎘通過DNA氧化損傷途徑誘發中心體擴增，并通過本研究驗證這個假說，研究內容包括鎘是否能誘發中心體擴增，以及鎘是否通過誘發DNA氧化損傷而導致中心體擴增。

1 材料與方法

1.1 材料

結腸癌細胞HCT116為本實驗室保存，在37℃、5%CO2培養箱中，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青、鏈霉素）的DMEM培養基培養，直到細胞貼壁生長，當細胞密度長至70%左右，細胞狀態良好時即可進行實驗處理。

DMEM培養基、胰酶購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；活性氧檢測試劑盒夠自碧云天生物技術公司；彗星電泳試劑盒夠自TER?VIGEN公司；抗體及其他試劑購自Sigma公司。

1.2 MTT實驗檢測細胞活性

收集對數生長期的細胞，在96孔板中每孔接種約5×103個，設置3個復孔，培養箱中培養24 h，然后用不同濃度的CdCl2處理48 h，對照組加入等量的ddH2O；CdCl2處理結束后每孔加入15 μL MTT試劑（5 mg/mL），在培養箱中培養3 h；棄掉每孔的培養基，加入 150 μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕振蕩混勻10 min使結晶充分溶解，用酶標儀測定每孔的D490nm值，進行數據處理。

1.3 免疫熒光實驗

在6孔板的每孔各放入2～3個蓋玻片，收集對數生長期的細胞，以5×103/孔的密度接種；爬片后的細胞用甲醛丙酮體積比為1∶1的混合液在-20℃冰箱中固定6 min；用PBS洗3次（每次10 min）；細胞在0.1%Triton X-100和3%牛血清白蛋白（BSA）（PBS配制）中分別孵育15 min和1 h；細胞在用3%BSA稀釋的一抗中孵育過夜，4℃下用PBS洗3次（每次10 min）；細胞在用3% BSA稀釋的二抗中室溫避光孵育1 h；用PBS洗3次（每次10 min）；用DAPI染細胞，封片；在熒光顯微鏡下用油鏡觀察每個細胞的中心體數目。

1.4 ROS檢測

用ROS檢測試劑盒檢測細胞內ROS變化。收集對數生長期的細胞，以2.5×104/孔的密度鋪24孔板，培養箱中培養24 h后CdCl2處理2 h；去除培養液，加入500 μL熒光探針DCFH-DA，培養箱中孵育20 min后用無血清培養基洗滌細胞3次；收集細胞，用PBS重懸，均勻離心，重復2次后用1 mL PBS重懸均勻；各吸200 μL于96孔板中，熒光酶標儀檢測488 nm激發波長、525 nm發射波長處的熒光值，然后進行數據處理。

1.5 彗星電泳實驗

裂解液在4℃預冷至少20 min；將低熔點瓊脂糖放在沸水中直到融化并保持5 min；將融化的瓊脂糖在37℃水浴中冷卻20 min；將細胞與融化的瓊脂糖（37℃）按體積比1∶10的比例混勻，并迅速滴50 μL到彗星玻璃片上；將玻片放入4℃黑暗保持10 min，使瓊脂糖充分凝固；將玻片浸沒在預冷的裂解液中30～60 min；將玻片浸沒在堿性解旋液中，室溫避光保持20 min或4℃保持1 h；電泳槽中加入4℃預冷的堿性電泳液，將玻片浸沒在電泳液中，20 V電壓下電泳30 min；將玻片用ddH2O輕輕沖洗2次，然后在70%的酒精中浸泡5 min，在37℃下將玻片干燥15 min；EB染料染片后在熒光顯微鏡下觀察，DNA在紫外光激發下會放射出橙紅色信號。

1.6 統計學分析

應用SPSS17.0統計軟件檢驗實驗所得數據的正態分布性，采用單因素方差分析分析各組間差異的顯著性，結果以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 CdCl2對HCT116細胞活性的影響

用不同濃度的CdCl2（0、10、20、40 μmol/L）處理HCT116細胞48 h，如圖1所示，隨著CdCl2濃度的增加，細胞活性逐漸降低（P＜0.01），呈劑量依賴效應。重要的是，20 μmol/L以下濃度的CdCl2對細胞活性幾乎沒有影響。

圖1 CdCl2對HCT116細胞活性的影響**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

2.2 CdCl2引起HCT116細胞中心體擴增

20 μmol/L及以下濃度的CdCl2對細胞活性沒有明顯的抑制作用。用20 μmol/L或以下濃度的CdCl2處理細胞，免疫熒光實驗觀察和計數中心體，細胞核由DAPI染色，呈現藍色，中心體呈現綠色，實驗處理誘發細胞產生中心體擴增，出現3個或以上的中心體形態（圖2）。鎘誘導中心體擴增并呈現劑量依賴效應（P＜0.01）（圖3）。

圖2 CdCl2處理后免疫熒光實驗觀察細胞中心體藍色熒光示細胞核，綠色熒光示中心體，箭頭指向擴增的中心體

2.3 CdCl2引起細胞內ROS升高

用無毒劑量的CdCl2（20 μmol/L）處理細胞2 h，檢測細胞內ROS水平，設置對照組、N-乙酰半胱氨酸（NAC）組、CdCl2組、CdCl2+NAC組。結果如圖4，CdCl2處理組的ROS水平明顯高于對照組（P＜0.01）；當同時有抗氧化劑NAC（提前1 h加）存在時，CdCl2升高細胞內ROS水平的活性被抑制（P＜0.01）。

2.4 CdCl2引起細胞DNA損傷

用無毒劑量的CdCl2（20 μmol/L）處理細胞，彗星電泳實驗檢測細胞的DNA損傷水平，結果如圖5，橙紅色示DNA，CdCl2處理后的細胞核出現彗星狀拖尾現象，彗星數量與對照組相比明顯升高（P＜0.01）；當加入抗氧化劑NAC后，鎘誘導產生彗星的能力受到抑制（P＜0.01）（圖6）。

圖3 CdCl2處理后HCT116細胞中心體的擴增率**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

圖4 CdCl2處理對細胞內ROS水平的影響**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

圖5 彗星電泳圖像

圖6 CdCl2處理細胞引起DNA斷裂**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

2.5 NAC降低CdCl2引起的中心體擴增率

用無毒劑量的CdCl2（20 μmol/L）處理細胞后，細胞中心體擴增率明顯升高（P＜0.01），而當加入NAC（提前1 h加）后，CdCl2誘導的中心體擴增明顯受到抑制（P＜0.01）（圖7）。

圖7 NAC對CdCl2處理誘導中心體擴增的影響**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

3 討論

中心體擴增的機制比較復雜，幾種潛在機制已被提出[11]：①在一個細胞周期中出現多次中心體的擴增；②胞質分裂失敗，導致基因組及中心體數目增加1倍；③中心粒不受控制的分裂。隨著研究的深入，發現越來越多的蛋白可能與之有關：腫瘤抑制因子p53在調控G1-S和G2-M檢驗點方面起著較為重要的作用，它的失活可導致中心體周期的失常[24]；人乳頭瘤病毒（HPV）E6和E7蛋白可能通過作用于不同的通路來阻礙中心體的自身平衡，E6可能通過使p53功能失活起作用，而E7可能通過滅活Rb導致中心體擴增[25]。Hol?mes等[15]報道稱重金屬能夠誘導中心體發生擴增，并且目前只有4種重金屬表現出誘導中心體擴增的能力，包括砷、六價鉻、汞和納米鈦顆粒，每種金屬通過不同的機制誘導中心體擴增。重金屬誘導的中心體擴增及其在致癌性和細胞毒性中的作用尚未見研究報道。我們的實驗表明，在低濃度的對細胞活性沒有明顯抑制的無毒性劑量下，鎘會誘發明顯的中心體擴增現象，這進一步證實了我們最近的報道[26]。

ROS在包括癌癥在內的各種人類疾病的發生中發揮重要作用。已有報道[1,12]表明鉛、鎘、汞、鉻和砷等重金屬是ROS的常見外源誘導物，可直接或間接誘導ROS產生。Son等[5]研究發現ROS直接參與了鎘誘導的癌變過程，并且提示AKT/ GSK-3β/β-catenin信號通路在此過程中的作用。我們的研究同樣表明暴露在低濃度重金屬鎘下，細胞內的ROS水平急劇增加，而當加入抗氧化劑NAC之后，ROS水平會明顯下降。

Filipic等[27]的研究表明，即使在低濃度的情況下，鎘也能通過誘導DNA損傷和抑制DNA損傷修復來誘導突變。Yuan等[1]同樣闡明重金屬直接或間接誘導ROS產生并導致胃癌黏膜和DNA損傷，隨后改變基因調控、信號轉導和細胞生長，最終導致癌癥的發生。Skipper等[2]采用彗星電泳檢測到CdCl2能以濃度依賴的方式造成肝癌細胞HepG2的DNA損傷。我們的實驗表明在低濃度鎘處理下，ROS和DNA斷裂水平都升高，加入抗氧化劑NAC后細胞內的ROS水平受到抑制，DNA損傷水平明顯降低。這提示鎘可以誘發DNA的氧化損傷。

我們的實驗表明低濃度無毒劑量的鎘處理會誘導細胞內中心體的擴增，同時會造成細胞內ROS水平的升高和DNA水平的損傷。因此，我們想探討ROS和DNA損傷在鎘誘導中心體擴增的過程中扮演什么角色。當加入抗氧化劑NAC后，ROS水平和DNA損傷水平均明顯下降，并且對鎘誘導的中心體擴增有明顯的抑制。這提示鎘通過DNA氧化損傷途徑來誘導中心體擴增。

總之，以上研究結果提示鎘通過DNA氧化損傷途徑誘導中心體擴增。因為中心體擴增能使非腫瘤細胞演變為腫瘤細胞，所以中心體擴增可能是鎘致癌的生物學機理。

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