寨卡病毒囊膜E蛋白的原核表達(dá)及其抗體制備

王佳美，鞏新，劉黨生，吳軍，劉波

1.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；

2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）屬于黃病毒科黃病毒屬，黃病毒家族成員還包括黃熱病毒（YFV）、登革熱病毒（DENV）、日本乙型腦炎病毒（JEV）、西尼羅病毒（WNV）、蜱傳腦炎病毒（TBEV）等[1]。只有約20%寨卡病毒感染者會出現(xiàn)輕微癥狀，2～7 d可自愈。但如果孕婦感染了寨卡病毒，病毒會通過胎盤屏障感染胎兒，病情較為嚴(yán)重，導(dǎo)致新生兒小頭癥[2]和格林-巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）[3]。世界衛(wèi)生組織（WHO）曾在2016年2月宣布將寨卡病毒列為全球公共衛(wèi)生緊急事件。

寨卡病毒只有一種血清型，電鏡下形態(tài)呈球形顆粒，有囊膜，基因組為單股正鏈RNA，全長約10.8 kb，兩端是非編碼區(qū)，中間有一段開放讀框，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、前體膜蛋白PrM、囊膜蛋白E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）[4]，結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒顆粒的各個結(jié)構(gòu)，非結(jié)構(gòu)蛋白參與基因組復(fù)制和功能性多聚蛋白的合成。當(dāng)寨卡病毒入侵宿主細(xì)胞時，在低pH值環(huán)境下，病毒包膜E蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)病毒粒子與細(xì)胞膜融合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（RMF）釋放寨卡病毒本身的核酸到宿主細(xì)胞，囊膜（envelope，E）蛋白能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性抗體，前體膜（Premembrane，PrM）蛋白在E蛋白構(gòu)象的正確折疊和病毒出胞過程中起重要作用，因此目前這2種蛋白常作為黃病毒疫苗設(shè)計和研發(fā)的首選[5]。我們前期以實驗室糖基工程酵母平臺為基礎(chǔ)，開展了糖基工程酵母制備寨卡病毒E蛋白亞單位疫苗的研究，結(jié)果表明商業(yè)化寨卡病毒E蛋白抗體效價較低，特異性較差，檢測結(jié)果不理想。因此，在本研究中，我們根據(jù)文獻(xiàn)報道選取了E蛋白抗原表位較集中的200個氨基酸片段（138～338）作為目的片段（圖1）[6]，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白，以該蛋白為抗原免疫小鼠，獲得了針對寨卡病毒E蛋白的特異性多克隆抗體，為后續(xù)開展寨卡病毒E蛋白亞單位疫苗的研究提供檢測工具。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡BALB/c雌鼠由維通利華公司提供；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，Q5熱啟動高保真DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶購自全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pET22b由本室保存；DNA提取試劑盒及瓊脂糖凝膠基因片段回收試劑盒購自天根生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。

LB/Amp培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化鈉，100 mg/L氨芐青霉素。

Ⅰ號培養(yǎng)基：20 g/L酵母抽提物，10 g/L胰蛋白胨，PB緩沖液（pH7.0）濃度為50 mmol/L。

1.2 目的基因的獲取

從NCBI網(wǎng)站獲取寨卡病毒E蛋白全基因序列（GenBank：KU312315.1），由上海生工生物工程有限公司合成該基因。以合成的基因為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報道選取抗原表位較集中的200個氨基酸（138～338）作為插入片段，設(shè)計引物ZIKVE5（5'-GCTCTTAAGATGAGAATCATGTTGTCCGTTCAT-3',下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點）和ZIKVE3（5'-GTCGAGCTCACCACCACCACCACCGTCAGTACCAG CGTATTGAAC-3'，下劃線序列為XhoⅠ酶切位點），PCR擴(kuò)增ZIKV-E200基因片段，用DNA片段回收試劑盒回收PCR片段。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

質(zhì)粒pET22b和回收的片段用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切，DNA回收試劑盒分別回收載體和片段，用T4DNA連接酶連接回收后的載體和片段，將連接后的重組載體熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定陽性克隆。

圖1 寨卡病毒E蛋白

1.4 重組載體在原核細(xì)胞中的表達(dá)

將測序正確的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，在5 mL LB/Amp液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)15 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組表達(dá)質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于5 mL LB/Amp液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)15 h，按10%的接種量接到200 mLⅠ號培養(yǎng)基中，待菌密度（D600nm值）為0.6時，用IPTG（終濃度1 mmol/L）誘導(dǎo)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h。用同樣方法培養(yǎng)和誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對照。

1.5 目的蛋白的分離

回收重組表達(dá)菌體和對照菌體，超聲波破碎，破碎后的對照菌體于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｆ扑楹蟮闹亟M菌體于12 000 r/min離心10 min，沉淀用2 mol/L尿素溶解2 h，12 000 r/min離心10 min，將上清液和沉淀分開，分別用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，用6 mol/L尿素繼續(xù)溶解沉淀2 h，12 000 r/min離心10 min，上清和沉淀用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，將表達(dá)的目的蛋白切膠回收，用研缽研細(xì)至1 mL注射器可抽吸，用少量生理鹽水重懸，加入等量的弗氏佐劑，冰浴超聲波混勻。

1.6 抗寨卡病毒E蛋白多克隆抗體的制備

將制備好的抗原皮下注射BALB/c小鼠，21 d后進(jìn)行第2次免疫，再21 d后進(jìn)行第3次免疫，14 d后每只小鼠眼眶取血約600 μL，12 000 r/ min離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western印跡檢測血清中多克隆抗體的特異性

用糖基工程酵母表達(dá)的帶有His-tag標(biāo)簽的寨卡病毒E全長重組蛋白檢測多克隆抗體的特異性。將表達(dá)寨卡病毒E蛋白的酵母菌裂解液和空白酵母菌裂解液分別用15%的SDS-PAGE分離，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上（15 V，20 min），用5%脫脂奶粉封閉1 h，以收集的鼠血清為一抗（稀釋度1∶3000）孵育1 h，以辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗（稀釋度1∶10 000）孵育1 h，對照組用抗His-tag抗體孵育，化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲取

按照方法1.1所述，以ZIKVE5和ZIKVE3為引物，PCR擴(kuò)增出約600 bp的目的片段（圖2），用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，克隆到載體pET22b相應(yīng)的酶切位點上（圖3），構(gòu)建成pET22b-ZIKV-E200重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用菌落PCR鑒定陽性克隆（圖4），測序結(jié)果顯示插入表達(dá)載體pET22b-ZIKV-E200的ZIKV-E200編碼基因序列完全正確。

2.2 重組載體在原核細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 ZIKV-E200基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜M：Trans 2K plusⅡDNA marker；1：ZIKV-E200基因（600 bp）

圖3 pET22b-ZIKV-E200表達(dá)質(zhì)粒

圖4 菌落PCR篩選陽性克隆M：Trans 2K plusⅡDNA marker；1～5：陽性克隆

回收的菌液12 000 r/min離心5 min后，吸除培養(yǎng)上清，濕菌稱重，按重量比1∶100加水重懸菌體，超聲波破碎菌體，12 000 r/min離心15 min，沉淀按原濕菌重加水重懸，用15%SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)目的條帶相對分子質(zhì)量約為25 000，與理論值一致，并且目的蛋白以包涵體形式存在于破菌沉淀中（圖5）。破碎后的離心沉淀用2 mol/ L尿素溶解，溶解后的上清液和沉淀分別用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖6），用6 mol/L尿素繼續(xù)溶解沉淀，溶解后的上清液和沉淀分別用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖7），表達(dá)蛋白大部分存在6 mol/L尿素溶解上清中。

2.3 Western印跡檢測血清中的多克隆抗體

圖5 重組菌表達(dá)的SDS-PAGE圖譜M：Blue plusⅡprotein王佳美、marker；1：菌液離心沉淀；2：菌液離心上清

圖6 2 mol/L尿素溶解后SDS-PAGE圖譜M：Blue plusⅡprotein王佳美、 marker；1：2 mol/L尿素溶解后離心沉淀；2：2 mol/L尿素溶解后離心上清

圖7 6 mol/L尿素溶解后SDS-PAGE圖譜M：Blue plusⅡprotein王佳美、 marker；1：6 mol/L尿素溶解后離心上清；2：6 mol/L尿素溶解后離心沉淀

利用3次免疫后獲得的鼠血清為一抗、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western印跡，檢測該血清中多克隆抗體的特異性，用抗His-tag抗體作為對照，檢測實驗室利用糖基工程酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白的全長片段。結(jié)果在相對分子質(zhì)量50 000～60 000處出現(xiàn)了特異性條帶，與理論值（54 000）接近，而在空白酵母菌裂解液中沒有檢測到特異性條帶，與抗His-tag抗體檢測結(jié)果一致（圖8）。

3 討論

我們利用大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)了ZIKVE200蛋白，免疫小鼠后獲得的多克隆抗體檢測到了酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白，蛋白大小與抗His-tag抗體檢測結(jié)果一致，表明該多克隆抗體可用于酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白的檢測等研究。

近年來寨卡病毒疫情迅速蔓延，已成為威脅全球人類健康的潛在因素，目前尚無針對性的特效藥和預(yù)防性疫苗，因此對于寨卡病毒致病機(jī)制、免疫策略、治療手段的研究已經(jīng)是當(dāng)務(wù)之急。在前期研究中，我們用糖基工程酵母表達(dá)了寨卡病毒E蛋白，因為商業(yè)化寨卡病毒E蛋白抗體，靈敏度不夠，難以檢測寨卡病毒E蛋白基因在工程酵母中的表達(dá)情況，所以本研究的目的是獲得寨卡病毒E蛋白的檢測抗體。為提高表達(dá)效率，我們根據(jù)文獻(xiàn)報道選取E蛋白抗原表位較集中的200個氨基酸片段作為目的片段[6]，利用大腸桿菌培養(yǎng)條件簡單、生長速度快、表達(dá)產(chǎn)量高的優(yōu)點，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)了ZIKV-E200重組蛋白截短片段。可能由于蛋白自身疏水性較高，蛋白是以包涵體形式表達(dá)的，包涵體須經(jīng)過復(fù)雜的溶解、復(fù)性、純化才能獲得有活性的蛋白，因此采用尿素溶解、切膠回收目的蛋白的方法制備免疫抗原，免疫BALB/c小鼠后獲得了多克隆抗體，針對酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白特異性較高，為寨卡病毒亞單位疫苗后續(xù)研究提供了檢測抗體。

圖8 抗ZIKV-E200多克隆抗體的Western印跡M：EasySeeⅡWestern marker；1：ZIKV E蛋白以抗His-tag抗體為一抗；2：空白菌（裂解液）以抗His-tag抗體為一抗；3：ZIKV E蛋白以抗ZIKV-E200血清為一抗；4：空白菌（裂解液）以抗ZIKV-E200血清為一抗

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