食甲基桿菌J1-1吡咯喹啉醌生物合成突變株的篩選和鑒定

李彤，景愛霞，楊亞欣，劉曉陽(yáng)，汪建華，劉黨生，熊向華，張惟材

1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinine，PQQ）是20世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)的繼煙酰胺核苷酸和黃素核苷酸后第三類氧化還原酶的輔酶[1]，具有抗氧化、清除氧自由基、增強(qiáng)線粒體功能、保護(hù)心肌損傷、促進(jìn)認(rèn)知等多種生理功能[2-4]。PQQ的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。化學(xué)合成步驟多、成本高、易造成環(huán)境污染，而生物合成周期短、成本低，被認(rèn)為是最有前景的工業(yè)化生產(chǎn)路線。迄今發(fā)現(xiàn)只有某些革蘭陰性菌能產(chǎn)生PQQ，如乙酸鈣不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、扭脫甲基桿菌、氧化葡糖桿菌等[5]。目前PQQ合成基因以及PQQ的生物合成途徑還不完全清楚。從革蘭陰性菌分離到的PQQ合成基因包括pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF、pqqG，大多以基因簇的形式存在。其中pqqA基因編碼的小肽PqqA含有PQQ生物合成的骨架物質(zhì)谷氨酸和酪氨酸，被認(rèn)為是PQQ合成的前體；PqqB可能與PQQ的跨膜運(yùn)輸有關(guān)；PqqC負(fù)責(zé)催化PQQ合成最后一步反應(yīng)；PqqD的功能尚不清楚；PqqE的作用可能是連接前體中的谷氨酸和酪氨酸殘基；PqqF、PqqG在PQQ合成中可能發(fā)揮內(nèi)切酶的作用[6]。

本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離篩選到一株P(guān)QQ產(chǎn)生菌MP688，后經(jīng)誘變得到高產(chǎn)菌株J1-1。已完成MP688的全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其中PQQ合成基因包括基因簇pqqABCDE和pqqFG，以及4個(gè)單獨(dú)拷貝的pqqA基因[7]。在此，我們通過Tn5轉(zhuǎn)座誘變技術(shù)進(jìn)一步篩選食甲基桿菌J1-1中參與PQQ生物合成的相關(guān)基因，為闡明PQQ的生物合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

食甲基桿菌J1-1、大腸桿菌λ-pir感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒pCM66和pGX由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、快速質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；ENTn5＜R6Kγori/KAN-2＞TNP Transposome Kit購(gòu)自Epicentre公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司；DNA聚合酶、pEASY-Uni SeamLess Cloning and Assembly Kit、T4DNA連接酶、DNA marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物（表1）合成及測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃滅菌20 min。

HC培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42.8 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO46.0 g/L，MnCl2· 4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4· 5H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵60.0 mg/L，甲醇10 mL/ L，pH7.0，115℃滅菌30 min。

1.2 分子生物學(xué)操作

PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學(xué)操作參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[8]。

1.3 Tn5突變體庫(kù)的構(gòu)建

從 EN-Tn5＜R6Kγori/KAN-2＞TNP Transpo?some Kit中取1 μL Transposome加入J1-1感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴5 min混勻后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電擊杯中，2.5 kV電擊后迅速加入500 μL HC培養(yǎng)基，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4 h，涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的HC平板上，倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落于5 mL HC Kan抗性試管中，30℃、200 r/min培養(yǎng)4 d，連續(xù)傳3代后仍有Kan抗性，說明轉(zhuǎn)座序列可以穩(wěn)定傳代，以此方法建立突變體庫(kù)。

表1 PCR引物序列

1.4 PQQ合成缺陷突變株的篩選及PQQ合成水平檢測(cè)

PQQ是一種棕紅色小分子化合物，食甲基桿菌J1-1在發(fā)酵過程中，PQQ被逐漸分泌到胞外，使發(fā)酵液呈紅色，發(fā)酵液顏色可直觀反映PQQ合成水平。挑取Tn5轉(zhuǎn)座突變體庫(kù)上的單菌落于5 mL HC液體培養(yǎng)基中，以J1-1為對(duì)照，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，挑選發(fā)酵液顏色呈白色且與對(duì)照菌發(fā)酵液顏色差異較大的菌株作為初篩突變株，進(jìn)一步采用分光光度法[9]檢測(cè)發(fā)酵液中PQQ合成水平。

1.5 質(zhì)粒拯救法鑒定插入位點(diǎn)

突變菌株基因組提取按照基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行。選擇適當(dāng)限制性內(nèi)切酶單酶切突變株基因組，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌λ-pir感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含50 μg/mL Kan的LB抗性平板上，挑取單菌落37℃振蕩培養(yǎng)，12 h后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，由華大公司用引物SeFP/SeRP測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過NCBI的BLAST比對(duì)，確定Tn5插入位點(diǎn)。

1.6 mpq0056基因敲除

以J1-1基因組為模板，選用引物up1500-F/ up1500-R和down1500-F/down1500-R分別擴(kuò)增上、下游同源臂基因；以質(zhì)粒pGX-Gm為模板，選用引物Gm-F/Gm-R擴(kuò)增慶大霉素（Gm）基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒純化。將上、下游同源臂基因，Gm基因和經(jīng)XhoⅠ、NotⅠ雙酶切的載體pGX-Gm用pEASYUni SeamLess Cloning and Assembly Kit重組轉(zhuǎn)化，獲得pGX-up-Gm-down重組質(zhì)粒。

以pGX-up-Gm-down質(zhì)粒為模板，選用引物up1500-F/down1500-R擴(kuò)增片段-up-Gm-down-，純化后電擊轉(zhuǎn)入J1-1感受態(tài)細(xì)胞，從HC抗性平板上挑取單菌落，通過組合PCR驗(yàn)證敲除菌。

1.7 mpq0056基因回補(bǔ)及過表達(dá)

用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件BPROM預(yù)測(cè)mpq0056基因的啟動(dòng)子位置。以J1-1基因組為模板，用引物mpq0056-F/mpq0056-R擴(kuò)增mpq0056啟動(dòng)子及編碼基因，回收純化DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ分別雙酶切載體pCM66及目的DNA并膠回收純化，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。

將質(zhì)粒pCM66-0056分別電擊轉(zhuǎn)化野生菌J1-1和敲除菌J1-1Δ0056，構(gòu)建過表達(dá)菌株和回補(bǔ)菌株。HC抗性平板培養(yǎng)2～3 d后，挑取單克隆于HC液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒復(fù)轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α中，測(cè)序鑒定。

1.8 菌株生長(zhǎng)評(píng)價(jià)

挑取野生菌J1-1、突變菌1-52、敲除菌J1-1Δ 0056、回補(bǔ)菌和過表達(dá)菌單菌落于5 mL HC液體培養(yǎng)基中，30℃活化24 h，分別按1%的接種量接種至100 mL HC液體培養(yǎng)基中，30℃同步培養(yǎng)，間隔12 h取樣測(cè)定D600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 Tn5轉(zhuǎn)座突變體庫(kù)構(gòu)建

對(duì)J1-1進(jìn)行Tn5轉(zhuǎn)座誘變，通過Kan抗性篩選，構(gòu)建得到庫(kù)容量為1.0×105的突變體庫(kù)。以突變株基因組為模板，用引物Kan-F/R、MOD-F/R PCR擴(kuò)增Kan與轉(zhuǎn)座序列，分別獲得約800和1923 bp的特異性條帶，與預(yù)期相符（圖1），表明轉(zhuǎn)座序列已插入受體菌株染色體基因組。

2.2 Tn5轉(zhuǎn)座突變株的篩選和插入位點(diǎn)鑒定

經(jīng)Tn5突變體庫(kù)篩選獲得1株P(guān)QQ產(chǎn)量顯著降低的突變株1-52，該突變株發(fā)酵液接近白色（圖2）。將該突變株基因組單酶切自連轉(zhuǎn)化后，從Kan抗性平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST后，確定插入基因?yàn)閙pq0056（Chorismate lyase，ubiC）（圖3）。

2.3 mpq0056基因敲除

2.3.1mpq0056基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 采用引物up1500-F/up1500-R和down1500-F/down1500-R菌落PCR驗(yàn)證構(gòu)建的敲除質(zhì)粒pGX-up-Gm-down，均在1500 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期相符（圖4）。將敲除質(zhì)粒送北京六合華大公司測(cè)序，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3.2mpq0056基因敲除菌的鑒定 選用引物up1700-F/Gm-R、Gm-F/down1700-R、Gm-F/Gm-R，以敲除菌基因組為模板進(jìn)行組合PCR鑒定，應(yīng)分別擴(kuò)增出2500、2500、800 bp的片段，而以野生菌基因組為模板時(shí)應(yīng)為陰性結(jié)果，結(jié)果與以上預(yù)期完全一致（圖5），說明mpq0056基因敲除成功。

圖1 缺陷株抗性基因及轉(zhuǎn)座片段的PCR鑒定M：DNA marker；1：空白對(duì)照；2：陽(yáng)性對(duì)照；3：1-52 PCR擴(kuò)增Kan序列；4：1-52 PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)座序列

圖2 野生菌J1-1和突變株1-52發(fā)酵液

圖3 1-52突變株Tn5插入位點(diǎn)

圖4 pGX-up-Gm-down菌落PCR鑒定M：DNA marker；1：空白對(duì)照；2：陽(yáng)性對(duì)照；3：mpq0056上游同源臂基因；4：mpq0056下游同源臂基因

圖5 敲除菌J1-1Δ0056的組合PCR鑒定M：DNA marker；1：空白對(duì)照；2：野生菌（up1700-F/Gm-R）；3：敲除菌（up1700-F/Gm-R）；4：野生菌（Gm-F/down1700-R）；5：敲除菌（Gm-F/down1700-R）；6：野生菌（Gm-F/Gm-R）；7：敲除菌（Gm-F/Gm-R）

2.4 mpq0056基因回補(bǔ)及過表達(dá)

用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件BPROM預(yù)測(cè)結(jié)果顯示在mpq0056基因上游200 bp內(nèi)存在啟動(dòng)子序列（圖6）。將mpq0056基因啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)克隆到載體pCM66中，構(gòu)建pCM66-0056載體，經(jīng)XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切后出現(xiàn)2條DNA帶，約8000 bp的條帶與載體pCM66大小一致，約700 bp的條帶與mpq0056的啟動(dòng)子和編碼區(qū)片段大小一致（圖7），表明pCM66-0056重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

提取回補(bǔ)菌株和過表達(dá)菌株質(zhì)粒復(fù)轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，用引物mpq0056-F/mpq0056-R測(cè)序，結(jié)果顯示回補(bǔ)株和過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

2.5 菌株表型鑒定

用分光光度法檢測(cè)突變株1-52的生長(zhǎng)及PQQ合成水平，突變株生長(zhǎng)速度略慢，同時(shí)PQQ合成水平只有野生株的1/7～1/6。向突變株培養(yǎng)基中額外添加終濃度為10 mg/L的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品（用“+”表示），突變株的生長(zhǎng)基本恢復(fù)正常，但單位細(xì)胞的PQQ合成水平依然很低（圖8）。表明突變基因mpq0056與PQQ的生物合成是有關(guān)聯(lián)的。

敲除mpq0056基因后，敲除菌生長(zhǎng)正常，單位細(xì)胞PQQ合成水平下降顯著，與Tn5誘變得到的結(jié)果相符；回補(bǔ)及過表達(dá)菌株的生長(zhǎng)均正常，回補(bǔ)基因mpq0056后，PQQ合成水平回復(fù)到野生菌水平（圖9）。以上結(jié)果進(jìn)一步說明基因mpq0056與PQQ的生物合成是相關(guān)的。

3 討論

隨著后基因組時(shí)代的到來，發(fā)現(xiàn)新基因和挖掘功能基因的方法越來越多，其中構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變體庫(kù)是最直接有效的方法之一。Tn5轉(zhuǎn)座子是復(fù)合型轉(zhuǎn)座子，在宿主中單拷貝復(fù)制。相比于常規(guī)的轉(zhuǎn)座技術(shù)，Tn5具有突變性狀穩(wěn)定、突變基因容易定位、抗性篩選等優(yōu)勢(shì)[10]，操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高，能夠快速獲得大量穩(wěn)定遺傳的Tn5轉(zhuǎn)座突變株。實(shí)踐證明利用Tn5轉(zhuǎn)座誘變篩選食甲基桿菌J1-1中PQQ合成基因的方法是可行的。前期研究發(fā)現(xiàn)，J1-1可利用的碳源并不多，其中以甲醇和果糖為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)良好，當(dāng)PQQ合成基因pqqBCDE敲除后，在果糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，卻不能利用甲醇為碳源生長(zhǎng)，當(dāng)敲除菌中加入痕量的外源PQQ后菌體生長(zhǎng)正常，這一現(xiàn)象說明菌體利用甲醇為碳源時(shí)是PQQ依賴的。本研究經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座誘變篩選PQQ合成基因是在以甲醇為碳源的平板上篩選，因以甲醇為碳源時(shí)PQQ合成水平高，表型明顯，便于篩選，但目前這種方法只能篩選到PQQ合成水平下降的突變株，不合成PQQ突變株在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。后續(xù)將嘗試?yán)靡怨菫樘荚吹钠桨暹M(jìn)一步篩選PQQ合成基因。

圖6 mpq0056上游前200 bp的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析

圖7 pCM66-0056雙酶切鑒定M：DNA marker；1：pCM66-0056質(zhì)粒XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切

圖8 突變株1-52的生長(zhǎng)及PQQ合成水平檢測(cè)

圖9 mpq0056基因敲除、回補(bǔ)及過表達(dá)菌生長(zhǎng)和PQQ合成水平檢測(cè)

綜上，經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座誘變獲得一株插入位點(diǎn)為mpq0056的PQQ合成缺陷突變株，BLAST分析結(jié)果表明該基因編碼產(chǎn)物可能是分支酸裂合酶，Nichols[11]等研究顯示該酶在大腸桿菌中催化分支酸生成丙酮酸和對(duì)羥基苯甲酸，一方面作為泛醌類物質(zhì)合成的前體，參與催化泛醌生物合成的第一步反應(yīng)，另一方面作為芳香族氨基酸生物合成的中間代謝產(chǎn)物。通過基因組位置分析發(fā)現(xiàn)，mpq0056與上游基因mpq0055（ATP-dependent DNA helicase RecG）間隔區(qū)為73 bp，經(jīng)在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件BPROM分析顯示此間隔區(qū)存在啟動(dòng)子序列，提示mq0055與mpq0056基因不是同一基因簇，未影響上游基因功能；與下游基因mpq0057（4-hydroxybenzoate polyprenyl transferase，ubiA）間隔區(qū)為78 bp，功能注釋存在相關(guān)性。我們推測(cè)食甲基桿菌J1-1中基因mpq0056影響PQQ生物合成的機(jī)制可能是通過影響芳香族氨基酸的代謝，間接影響PQQ前體物質(zhì)合成。其影響機(jī)制須后續(xù)實(shí)驗(yàn)闡明。

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