人突觸囊泡蛋白2C單克隆抗體的制備及鑒定

邱語進，孫志杰，趙鵬，付楚溪，霍江，熊向華，汪建華，萬冬梅，張惟材

1.遼寧大學 生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；4.沈陽師范大學，遼寧 沈陽 110034；5.解放軍第307醫院 麻醉科，北京 100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是一類由厭氧肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botuli?num）產生的神經毒素，是迄今已知毒性最強的蛋白毒素[1-3]。肉毒毒素共有7種血清型（A～G），其中A型最為常見，近年來已應用于美容和治療偏頭痛、眼能動性、運動障礙等疾病[4-5]。A型肉毒毒素由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接構成，重鏈的N端為跨膜區、C端為受體結合區，輕鏈為依賴Zn2+的內肽酶。A型肉毒毒素（BoNT/A）在神經肌肉接頭處與神經細胞表面的受體結合，借助重鏈N端跨膜將輕鏈送至胞內，通過切割突觸囊泡相關蛋白SNAP25從而阻斷神經遞質的釋放，引發肌肉持續的松弛性麻痹[6-7]。

突觸囊泡蛋白2（synaptic vesicle protein 2，SV2）是一類在內分泌泡及突觸囊泡廣泛表達的跨膜糖蛋白，包含12次跨膜的疏水結構域（trans?membrane regions，TMR），具有調節神經遞質釋放、內分泌泡胞吐作用、維持突觸囊泡穩態及參與神經肌肉接頭形成等生物學功能。Dong等研究發現SV2的3個亞型SV2A、SV2B、SV2C均可作為BoNT/A的受體，其中SV2C與BoNT/A的親和力最高[8]，其TMR7、TMR8之間的突觸泡大突環L4上的529～566位氨基酸與BoNT/A結合[7,9-10]。本研究中我們表達純化了SV2C/L4蛋白，免疫小鼠后經2輪篩選得到13株單抗，其中30號抗體與SV2C的親和力最高，且具有一定的中和活性。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明小鼠購自軍事醫學研究院實驗動物中心；大腸桿菌感受態細胞BL21（DE3）購自北京天根生化科技有限公司；pGEX-KG-SV2C/L4質粒由本課題組構建；脫脂奶粉購自生工生物工程股份有限公司；HRP標記的羊抗鼠IgG、TMB顯色液購自康為世紀生物科技有限公司；Western印跡試劑盒、Proteinlso GST Resin購自北京全式金生物技術有限公司；抗體亞類鑒定試劑盒購自北京博奧龍免疫有限公司；酶標板、細胞培養板購自康寧公司；PVDF膜購自Merk Millipore公司；HiTraP Protein G HP購自GE Healthcare公司。

1.2 制備抗原SV2C

將構建的pGEX-KG-SV2C/L4質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3），挑取陽性克隆接種于200 mL含氨芐青霉素（Amp）的LB培養基中，于37℃、220 r/min培養至D600nm為0.5～0.8，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于20℃誘導18 h，4℃、12 000 r/ min離心收集菌體，加20 mL裂解液重懸，置于冰上超聲波裂解菌體，4℃、12 000 r/min離心收集上清，按1∶2000的比例加入GST瓊脂糖珠，4℃結合2 h，先用洗滌緩沖液漂洗4次，后用洗脫緩沖液洗脫并收集洗脫液進行SDS-PAGE檢測。

1.3 雜交瘤細胞篩選

采用4只SPF級BALB/c雌性小鼠，每只小鼠初次免疫經皮下多點注射60 μg SV2C/L4蛋白，加強免疫3次后測定小鼠血清效價，選擇效價最高的小鼠提高免疫用量進行腹腔沖擊，培養10 d后分離小鼠脾細胞，采用PEG法與生長對數期的Sp2/0細胞融合，用半固體培養基（含HAT）篩選培養14～21 d，間接ELISA篩選陽性克隆。動物免疫與雜交瘤細胞初篩交由北京華大蛋白研發中心有限公司完成。

1.4 抗體效價測定

用5 μg/mL的SV2C抗原37℃孵育2 h，PBST洗滌3次；用5%脫脂牛奶37℃封閉2 h，PBS-T洗滌3次；細胞上清按1∶200稀釋作為起始濃度，然后按1∶2梯度稀釋共10個濃度，取100 μL依次加入酶標板，37℃孵育1 h，PBS-T洗滌3次；二抗羊抗鼠1∶2000稀釋，37℃孵育1 h，PBS-T洗滌3次；顯色5～10 min，終止反應后讀數。

1.5 抗體亞型鑒定

取細胞培養上清，按試劑盒說明書鑒定抗體亞型。

1.6 抗體制備

每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟預處理1周，之后經相同途徑注射0.5 mL濃度為2×106/mL的細胞懸液，7～10 d見小鼠腹部明顯膨大即可剖腹收集腹水，離心收集上清。用結合緩沖液稀釋小鼠腹水，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，Protein G親和柱上樣，平衡至基線平穩，加入洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，SDSPAGE鑒定后分裝于-20℃保存。

1.7 抗體結合表位類型鑒定

取20 μL純化蛋白進行SDS-PAGE，半干法轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS-T洗膜，待測抗體按1∶1000的比例稀釋，室溫孵育1 h，PBS-T洗膜，二抗羊抗鼠按1∶2000的比例稀釋，室溫孵育1 h，PBS-T洗膜，顯色。

1.8 抗體親和力常數測定

將不同濃度（5、2.5、1.25、0.625 μg/mL）的SV2C/L4抗原依次加入酶標板中包被，空白孔加入包被緩沖液，37℃孵育2 h；用5%脫脂牛奶37℃封閉2 h，PBS-T洗1次；將不同濃度（288 μg/mL，1/2梯度稀釋16個濃度）的一抗依次加到包被好的酶標板中，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；羊抗鼠二抗按1∶2000稀釋，37℃孵育1 h，PBS-T洗3次；避光顯色5～15 min后終止反應，雙波長測定吸光度值，記錄數據。

以抗體濃度的對數值為橫坐標，D值為縱坐標，利用GraphPad Prism 5軟件擬合出不同抗原濃度的EC50，按Beaty[11]推導的公式計算K值并求平均值，即為親和力常數。

1.9 抗體中和活性實驗

參照Diamant等的方法[12]進行。

2 結果

2.1 抗原SV2C/L4的純化

重組菌pGEX-KG-SV2C/L4/BL21（DE3）誘導表達后超聲波裂解，取裂解上清用于GST親和層析純化，SDS-PAGE分析顯示得到特異性純化蛋白條帶，與融合蛋白理論相對分子質量相符，Gel-Pro Analyzer軟件分析蛋白純度達到95%以上（圖1）。

圖1 目的蛋白純化的SDS-PAGE檢測M：蛋白marker；1，2：SV2C/L4純化蛋白

2.2 雜交瘤細胞篩選和抗體分型

用間接ELISA測定3次加強免疫后的4只小鼠的血清效價，結果見表1，1號小鼠血清效價最高，選取1號小鼠進行細胞融合實驗。

細胞融合實驗共進行2輪篩選，獲得13株陽性雜交瘤細胞，間接ELISA測定這13株細胞上清效價為6.4×103～1.024×105（表2），其中30號細胞上清的效價最高為1.024×105。測得抗體的重鏈大部分為IgG1、IgG2a型，輕鏈均為κ型（表2）。

圖2 SV2C抗體純化的SDS-PAGE檢測M：蛋白marker；1：SV2C抗體

2.3 抗體純化

小鼠腹水經Protein G柱親和層析純化，SDSPAGE分析抗體純度大于95%（圖2）。

2.4 抗體結合表位類型鑒定

Western印跡顯示并無明顯條帶，而ELISA結果表明鼠單抗可以與抗原SV2C/L4反應，由此推測該抗體結合表位類型是空間表位。

表1 小鼠血清效價

表2 13株抗體效價及亞型

2.5 抗體親和力常數測定

間接ELISA測定30號單抗與SV2C/L4抗原的親和力常數，結合反應曲線如圖3。用GraphPad Prism 5分析實驗數據，抗原濃度為5、2.5、1.25、0.625 μg/mL時所對應的EC50分別為0.570、1.083、2.334和2.203 ng/mL。代入公式K=2（nAbx-Aby）/（n-1）（n=x/y，x＞y），計算所得K值的平均值即為親和力常數。最終計算得到30號單抗與SV2C/L4抗原的親和力常數K=6.7 nmol/L。

2.6 抗體的中和活性

中和活性實驗結果表明，針對BoNT/A的30號抗體中和活性為100 LD50/mg。

圖3 抗體SV2C與抗原親和力常數

3 討論

傳統理論認為BoNT/A在神經細胞表面有神經節苷脂GT1b和SV2等2種受體[13-16]。GT1b是一種酸性鞘糖脂，在神經細胞表面數量較豐富，在細胞分化、信號轉導、細胞增殖等方面發揮重要作用[18]；SV2位于脊椎動物的突觸泡與內分泌泡上，與神經肌肉接頭形成、神經遞質的釋放相關。當BoNT/A進入神經肌肉接頭后，首先與神經細胞表面的GT1b結合并完成對毒素的富集[17]；富集的毒素再與神經細胞表面的蛋白受體SV2結合，并在SV2的介導下完成內吞[16]。但是，2013年Jacky等研究發現成纖維細胞生長因子受體3（fi?broblast growth factor receptor 3，FGFR3）是BoNT/ A的一種新受體[18]，其與毒素結合后會引發毒素內吞。目前BoNT/A的3種受體特別是2種蛋白受體（SV2/FGFR3）的相互關系還不明確，我們希望制備2種蛋白受體的抗體來研究它們之間的相互關系。本研究中我們通過免疫小鼠篩選陽性雜交瘤細胞來制備SV2C特異性抗體，經4次皮下注射和1次腹腔注射免疫BALB/c小鼠，選取血清效價最高的小鼠完成雜交瘤細胞制備，采用間接ELISA法進行2輪篩選，最終得到了13株抗體。選取效價最高的30號抗體制備純化腹水，純化抗體與SV2C抗原的親和力常數為6.7 nmol/L，對BoNT/A的中和活性為100 LD50。我們得到1株高純度、高親和力并對BoNT/A具有一定中和活性的抗SV2C鼠單抗，為我們研究BoNT/A受體的相互關系奠定了基礎。

目前，針對BoNT/A中毒的治療尚無有效的化學藥物，而臨床使用的馬多抗存在過敏反應等安全隱患，基因工程單抗是發展的主流方向。Nowakowski等獲得的S25、C25、3D12[19]和XOMA公司研發的NX01、NX02、NX11[20]單抗均具有很好的中和活性，但這些單抗都是針對BoNT/A的受體結合區。本研究篩選得到針對BoNT/A的SV2C受體的具有一定的中和活性的單抗，這一結果提示可以通過直接封閉BoNT/A的受體來達到治療目的，為肉毒中毒治療提供了新的途徑。

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