A型肉毒毒素單克隆抗體的制備和鑒定

呂孫慧，劉凌志，霍江，李磊，汪建華，游松，熊向華，張惟材

1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京100071；3.解放軍第307醫院 麻醉科，北京 100071；4.哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150076

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭菌（Clostridium botulinum）產生的一種毒性極強的蛋白類神經毒素，有A～F共7種血清型，其中引起人類肉毒中毒的有A、B、E、F型，A型毒性最強且最為常見[1]。成熟的A型肉毒毒素由一條重鏈和一條輕鏈通過一對二硫鍵連接而成，重鏈C端與神經肌肉接頭處神經細胞膜上的受體結合，是理想的保護性抗原，重鏈N端則負責將輕鏈轉運至神經細胞[2]；輕鏈是依賴Zn2+的蛋白酶[3]，切割SNARE復合物中的SNAP25蛋白，使突觸小泡與細胞膜無法融合，從而導致神經遞質不能釋放到神經肌肉接頭的細胞縫隙，引起肌肉麻痹[4]。

目前治療A型肉毒中毒沒有有效的小分子化學藥物，臨床上使用馬血清，但馬血清存在病毒污染、過敏反應等風險，以及制備成本高、生產期長、穩定性差等問題。單克隆抗體是取代馬血清的更理想的臨床藥物，而現有研究結果表明單個抗體難以起到理想的中和效果，多個抗體聯用的效果遠大于單個抗體效果的加和[5]。我們以A型肉毒毒素重鏈C端（heavy chain carboxy terminal of BoNT serotype A，BoNT/AHc）為抗原免疫小鼠，通過雜交瘤技術得到3株親和力高、特異性強的單抗，為A型肉毒毒素的抗體藥物研發，以及建立快速有效的肉毒毒素檢測方法奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（軍事醫學研究院實驗動物中心）；Sp2/0骨髓瘤細胞（陳薇研究員實驗室惠贈）；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑（Sigma公司）；抗體分型試劑盒（北京博奧龍免疫技術公司）；Protein-G親和層析柱（GE公司）；HRP標記的羊抗鼠IgG（Thermo公司）；96孔酶標板（NEST公司）；PVDF膜（Millipore公司）；SDS-PAGE樣品緩沖液（生工技術公司）。

1.2 小鼠免疫

選取雌性BALB/c小鼠（6～8周齡），將50 μg抗原BoNT-AHc與完全弗氏佐劑混勻，采用皮下多點注射的方式進行首次免疫；第21 d以相同劑量的BoNT-AHc與不完全弗氏佐劑混勻，以相同注射方式進行第2次免疫；第42 d不加佐劑，用相同劑量進行腹腔注射完成第3次免疫；第56 d以500 μg采用腹腔注射進行強化免疫；第59 d取脾臟進行融合。

1.3 細胞融合

強化免疫后3 d，將小鼠斷頸處死，用75%酒精消毒，在無菌狀態下將分離脾細胞的和Sp2/0骨髓瘤細胞按5∶1混合，采用PEG法[6]進行細胞融合，用含20%小牛血清的HAT選擇培養液重懸細胞濃度為1×106/mL，每孔100 μL加至96孔細胞培養板中，置37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.4 篩選陽性克隆及克隆化培養

選用HAT培養基培養融合細胞，7～10 d后換成HT培養液，培養2周后改用一般培養液。當雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可用ELISA法檢測特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3 d換一半培養液。

采用有限稀釋法將陽性孔進行克隆化培養，在克隆前1 d制備飼養細胞層。將篩選出的雜交瘤細胞計數，用培養液重懸細胞至3～10/mL，每孔100 μL加入提前制備的飼養細胞層培養板中，置37℃、5%CO2培養箱中培養，第7 d開始換液，以后每2～3 d換一次液，8～9 d可見細胞克隆形成，檢測細胞上清中抗體活性，將篩選出的陽性克隆株移至24孔板中擴大培養后凍存，同時測定細胞上清的效價。

1.5 抗體制備

每只小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，2周后取1×106雜交瘤細胞腹腔注射，接種細胞10 d后收集腹水，經飽和硫酸銨鹽析后用Protein-G親和層析柱純化。

1.6 抗體分型

取純化的抗體稀釋至1/1000，用抗體分型試劑盒鑒定鼠單抗亞類。

1.7 抗體純度測定

采用SDS-PAGE測定抗體的純度，取5 μg單抗加入2 μL上樣緩沖液和5 μL 1 mol/L的DTT，室溫放置30 min后煮沸5 min，進行膠濃度為12.5%的SDS-PAGE，掃描后用軟件Gelpro32分析計算抗體的純度。

1.8 抗體特異性結合鑒定

采用Western印跡。取5 μL BoNT/AHc抗原，進行膠濃度為12.5%的SDS-PAGE，半干法將蛋白轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入鼠單抗室溫孵育1 h，用PBST洗3次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗鼠IgG室溫孵育1 h，加入化學發光試劑，于化學發光分析儀中顯影并記錄。

1.9 抗體親和力常數測定

采用非競爭ELISA法測定抗原抗體結合的親和力常數。分別測定4個BoNT/AHc抗原濃度（20、10、5、2.5 μg/mL）與抗體的結合反應曲線，抗體取12個濃度（80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1562、0.7812、0.039 μg/mL）。用SPSS軟件進行曲線擬合后得出每個抗原濃度對應的最大D450nm值的一半時抗體的濃度。采用趙巧林報道的方法[7]計算抗體1B1、1B2、1C6的親和力常數。

1.10 單抗與抗原識別位點分析

采用疊加ELISA法計算抗體兩兩之間的疊加率AI。1 μg/mL的BoNT/AHc抗原于96孔酶標板中4℃包被過夜，陰性對照孔包被1 μg/mL牛血清白蛋白（BSA），空白對照孔不包被底物。用5%脫脂奶粉于37℃封閉2 h，加入單抗1，37℃孵育1 h，加入單抗2，37℃孵育1 h，PBST洗5次后加入稀釋至1/2000的HRP標記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，PBST洗5次后加入TMB顯色液顯色10 min，每孔加50 μL 2 mol/L的濃硫酸終止顯色，酶標儀測定D450nm值。用下式計算疊加率AI：

式中D1、D2、D1，2分別為單抗1、單抗2、單抗1疊加單抗2的D450nm值。若AI大于40%，即可認為這2株單抗識別位點不同；若AI小于40%，則可認為這2株單抗識別位點相同或相近。

2 結果

2.1 單克隆抗體篩選

BALB/c小鼠經免疫后，取脾細胞和Sp2/0骨髓瘤細胞融合，通過有限稀釋法進行2次克隆化，得到3株穩定表達抗體的陽性單克隆細胞株1B1、1B2、1C6，培養上清效價分別為1.2×105、4.1× 106和1.2×105。

2.2 抗體的制備

篩選到的3株陽性單克隆細胞株1B1、1B2、1C6經培養后注射到小鼠腹腔中制備腹水，通過硫酸銨鹽析和Protein-G親和層析純化，純化抗體經SDS-PAGE后采用Gelpro32軟件計算純度，分別為93.6%、98.4%、94.2%。

2.3 抗體分型

取純化后的抗體稀釋至1/1000，用試劑盒進行亞型鑒定，結果表明3株抗體重鏈均為IgG1，輕鏈均為κ型，是鼠源抗體重鏈和輕鏈最為常見的亞型。

2.4 抗體特異性結合鑒定

以BoNT/AHc為抗原，抗體1B1、1B2、1C6為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗進行Western印跡，結果顯示單抗1B1、1B2、1C6與BoNT/AHc抗原均有特異性結合，表明3株抗體與抗原結合表位均為線性表位。

2.5 抗體親和力常數

通過非競爭ELISA法測定4個濃度的BoNTAHc抗原與抗體的結合反應曲線，經SPSS軟件擬合后計算出1B1、1B2、1C6的親和力常數分別為1.43×108、2.31×108和1.44×109L/mol。3株抗體與抗原結合的親和力常數均高達108L/mol以上，可見3株抗體與抗原都有很強的結合能力。

2.6 單抗與抗原識別位點分析

采用疊加ELISA法計算抗體兩兩之間的疊加率AI，結果顯示3株抗體兩兩配對的AI值均小于40%，說明這3株單抗識別的位點相同或相近。

圖1 SDS-PAGE分析抗體純度M：蛋白marker；1：純化后的抗體1B1；2：純化后的抗體1B2；3：純化后的抗體1C6

圖2 Western印跡檢測鼠單抗與BoNT/AHc的特異性結合

表1 3株鼠單抗抗體分組結果

3 討論

相對全長肉毒毒素而言，BoNT/AHc是肉毒毒素與受體結合的區域，免疫動物后可以產生保護性免疫反應，且沒有輕鏈的內切酶活性帶來的毒性，是更理想的保護性抗原。文獻報道也顯示以BoNT/AHc作為抗原免疫小鼠獲得具有中和活性的抗體的可能性高于以類毒素作為抗原的傳統方法[8]。通過雜交瘤技術得到的鼠源單克隆抗體親和力高、特異性強、性質均一、易于大量生產，在醫學實踐及生命科學研究中應用廣泛。因而本次研究采用BoNT/AHc為抗原，通過雜交瘤單克隆抗體技術制備抗體，最終獲得了親和力高、特異性強的3株鼠單抗。后續研究一方面將測定3株抗體的中和活性以探討其成為A型肉毒中毒治療藥物的可能性，另一方面嘗試建立基于這3株抗體的A型肉毒毒素檢測方法（夾心ELISA或膠體金等）。

本研究得到的3株抗體與抗原結合表位相同或相近，而之前實驗室制備得到的4株抗BoNT/ AHc單抗與抗原也有相同或相近的結合表位[9]，Onda等報道同樣顯示其篩選得到針對PE的60株鼠單抗抗原識別位點僅分布在7個表位組中[10]，由此可見通過雜交瘤技術制備鼠單抗時存在抗原優勢表位。若其優勢表位同時也是抗原與受體結合的關鍵表位，則有利于中和抗體制備；若優勢表位和抗原與受體結合的關鍵表位不一致，則會加大中和抗體的篩選難度。如果是前者，可以考慮將篩選得到的針對不同表位的中和抗體聯合使用以增強中和活性。Hayashi等研究表明，將BoNT/AHc作為抗原得到的針對不同表位的3株單抗聯用，抗體效價能達到傳統抗血清的500倍[11]，可見抗體聯用可以很好地增強中和活性。

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