外源性谷氨酰胺在機體氧化應激中的抗氧化作用

李松濤，李大鵬，李松琳

氧化應激是各種因素刺激致機體組織或細胞內自由基生成和抗氧化防御間嚴重失衡，造成活性氧在機體或細胞內蓄積而引起細胞毒性反應，出現組織損傷的過程。加強脂質過氧化及抗氧化保護研究，根據臨床疾病模型研究使用抗氧化劑，選擇有效抗氧化劑進行抗氧化治療是現階段臨床重要研究課題［1－3］。

目前，大多抗氧化藥物作用機制尚不十分清楚，多數抗氧化治療未達到預期效果，尤其在天然抗氧化劑方面［4，5］。抗氧化劑對氧化應激的作用可通過超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）及過氧化氫酶（hydrogen peroxide enzyme，CAT）等生物學指標來測量［6］，據此筆者選擇體內天然存在的非必需氨基酸谷氨酰胺 （glutamine，Gln）為抗氧化劑，通過Wistar大鼠外源性補充Gln方式，以反映自由基代謝和抗氧化水平的SOD及CAT活性和反映脂質過氧化程度的丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平為監測指標，探討Gln在機體氧化應激中的抗氧化保護作用，現報告如下。

1　材料和方法

1.1實驗對象 選擇無特定病原體（specific pathogen free，SPF）健康雄性 Wistar大鼠（n=22），平均體重（0．266±0．022） kg，購于山東省魯抗醫藥股份有限公司（實驗動物生產許可證：SCXK（魯）2013－0001），恒溫、恒濕條件下適應性飼養7 d，自由進食及飲水。

1.2儀器與試劑 T－SOD、CAT活性及MDA水平測定儀器主要包括722型光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠，T－SOD檢測波長550 nm、1 cm光徑比色杯，CAT檢測波長405 nm、0．5 cm光徑比色杯，MDA檢測波長532 nm、1 cm光徑比色杯）、5810R臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）等。測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3實 驗

1.3.1動物分組 適應性飼養7 d后，22只大鼠隨機分為試驗組（A）、對照組（B）、標準組（C），其中 A，B兩組各8只，C組6只。實驗前大鼠均稱重并記錄。

1.3.2實驗方法 現有Gln口服制劑水溶性及穩定性差、細胞內利用率低，而丙胺酰谷氨酰胺在體內可迅速分解為丙氨酸和Gln，在發揮維持和修復腸道結構和功能等作用同時，可有效維持和提高細胞內、外 Gln 水平［7，8］，故選擇丙胺酰谷氨酰胺為實驗用藥。

A、B組實驗在屏障環境中進行，分別于每日上午進行2組實驗動物灌胃，1次/d，A、B組灌胃時間均為連續 14 d。 選擇實驗相關給藥方法［9，10］，A 組按照1 ml/100 g用藥劑量灌服丙胺酰谷氨酰胺注射液（海南靈康制藥有限公司，50 ml∶10 g），B 組按1 ml/100 g用藥劑量灌服0．9%生理鹽水。

實驗過程中，各組大鼠均自由飲水及相同標準飼料喂養。

1.3.3血液標本采集 A、B組實驗動物末次給藥后，均禁食24 h（自由飲水）進行血液標本采集。采血方式選擇頸動脈采集，留取血標本2 ml以上；C組實驗動物適應性飼養7 d，直接禁食（自由飲水）24 h后采集血液標本。血標本均按常規方法分離血清，－80℃保存待檢。

1.3.4指標測定 嚴格按試劑盒操作說明書要求進行標準品處理和實驗操作。T－SOD測定采用羥胺法，550 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為（262．79±23．24） U/ml；CAT 活性測定采用可見光法，405 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為0．2～24．8 U/ml；MDA 水平測定采用 TBA 法，532 nm 波長測各孔吸光度A，檢測范圍0～113 nmol/ml。

1.4統計學分析 計量資料以均數±標準差 （x±s）表示，使用SPSS 13．0統計學軟件進行處理。采用兩樣本均數差別t檢驗進行組間數據分析，p＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

（1）A～C 各組 T－SOD、CAT 活性及 MDA 水平檢測結果見表1。T－SOD活性檢測：A組高于B、C 2組，B組高于C組；CAT活性檢測：A組高于B、C 2組，B組高于C組；MDA水平檢測：A組低于B、C 2組，B 組低于 C 組。 （2）A～C 各組 T－SOD、CAT 活性及MDA水平組間差異比較見表1。

表1　T-SOD、CAT、MDA檢測值及組間比較結果

T－SOD活性組間差異均無統計學意義 （P＞0．05），表明試驗 A組 14 d時血清 T－SOD活性與標準組C間無顯著差異。CAT活性A與C組間差異有統計學意義（p＜0．05），B與C及A 與B組間差異均無統計學意義（P＞0．05），表明試驗 A 組 14d時血清CAT活性顯著高于標準組C。MDA水平組間差異均無統計學意義（P＞0．05），表明試驗 A 組 14 d時血清MDA水平與標準組C間無顯著差異 （P＞0．05）。

3　討論

過度氧化應激反應中SOD、MDA等指標具有不同程度的變化［11］，過量自由基生成MDA等脂質過氧化產物及新的自由基，并可進一步通過鏈式反應放大損害作用，引起細胞代謝功能障礙和死亡［12］。SOD主要清除體內的超氧陰離子自由基［13］，其活性強弱是衡量機體清除自由基及抗氧化能力的重要指標，間接反映氧自由基在體內生成和清除情況，以及對組織損傷程度；而MDA則反映氧自由基水平及間接反映細胞受自由基攻擊后脂質過氧化的嚴重程度。CAT可有效清除自由基，減輕及阻斷脂質過氧化反應等，間接反應抗氧化酶活性及機體清除自由基的能力［14－16］。

Gln在機體營養代謝、免疫保護、炎癥調節及增強機體免疫機能等方面具有重要作用［17，18］，可減少HK－2細胞缺氧復氧后的NF－kB的表達及細胞損傷，且外源性Gln對紅細胞膜Na+K+－ATP、Ca2+Mg2+－ATP酶活性及紅細胞膜穩定性具有顯著性影響［19，20］。

過度氧化應激及脂質過氧化是以SOD活性下降和MDA含量升高為特征［1］。本文實驗數據中：外源性補充Gln試驗組A與未進行任何處理標準組C 間的 CAT 差異有統計學意義（p＜0．05），補充生理鹽水的對照組B與標準組C間CAT差異無統計學意義（P＞0．05），14 d 時 A 組血清 CAT 活性水平顯著高于C組，表明外源性補充Gln可顯著提高血清抗氧化物酶CAT活性，顯著提高機體抗氧化能力。TSOD活性監測A組高于B、C組，B組高于C組，表明外源性補充Gln可提高血清抗氧化物酶SOD活性，提高機體清除自由基及抗氧化能力；MDA水平監測A組低于B、C組，B組低于C組，表明外源性補充Gln可降低血清MDA水平，減輕脂質過氧化程度，以上T－SOD活性及MDA水平各組間差異均無統計學意義（P＞0．05），組間均無顯著性影響，則可能與外源性補充Gln時間短及尚未達到一定水平有關。

補充外源性抗氧化劑及對機體機能影響研究是現階段重要課題［21］。該文選擇體內天然存在的Gln為抗氧化劑，通過外源性補充方式結合監測SOD、CAT、MDA指標變化，探討Gln在機體氧化應激中的抗氧化保護作用。根據實驗數據中T－SOD、CAT、MDA指標變化，表明Gln具有一定的抗氧化保護作用，提示其在發揮提高機體免疫功能和臨床治療效果同時［22，23］，可作為抗氧化劑使用，相關實驗數據為抗氧化保護、清除自由基及抑制組織細胞氧化損傷等研究提供支持，并有待于結合相關病理生理研究，在臨床工作中進一步推廣［24，25］。

［1］郭秀麗，徐有青，楊昭徐．水飛薊素對非酒精性脂肪性肝炎大鼠小腸組織抗氧化作用的實驗研究［J］．實用肝臟病雜志，2011，14（6）：407－409．

［2］李青，史琳娜，樊俊，等．補充抗氧化劑對急性心腦血管意外的老年病人血漿抗氧化劑水平的影響［J］．腸外與腸內營養，2010，17（4）：218－220，223．

［3］張蔚，黃伶，孫豐南，等．外源性抗氧化劑對老年全麻術后患者氧化/抗氧化系統的影響［J］．中國老年學雜志，2010，30（17）：2435－2436．

［4］唐金國，劉恪英．氧化應激在動脈粥樣硬化中的作用及抗氧化治療研究進展［J］．檢驗醫學與臨床，2013，10（14）：1885－1889．

［5］葛立．VitC對缺血性腦卒中早期氧化應激和短期預后的影響［J］．放射免疫學雜志，2013，26（4）：543－545．

［6］王志新，徐高磊，王延芬，等．氧化應激和抗氧化劑在糖尿病并發癥發生發展中可能的作用［J］．醫學研究雜志，2013，42（4）：12－15．

［7］徐偉，許海塵，陳國勝，等．丙胺酰谷氨酰胺治療老年胃腸道腫瘤 化 療相關性腹瀉 ［J］．江 蘇 醫 藥 ，2013，39（24）：3011－3012．

［8］ HAN T，LI XL，CAI DL，et al．Effects of glutamine－supplemented enteral or parenteral nutrition on apoptosis of intestinal mucosal cells in rats with severe acute pancreatitis［J］．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（11）：1529－1535．

［9］劉昳，葉峰，鄒文靜，等．黃芩對大鼠肝硬化內毒素血癥腸黏膜損傷的保護性機制研究［J］．中華實驗和臨床感染病雜志（電子版），2013，7（6）：797－803．

［10］王蕊，侯艷，楊蘭蘭，等．普洱茶對酒精性脂肪肝大鼠脂質過氧化的影響［J］．云南農業大學學報，2013，28（6）：845－850．

［11］彭土生，劉英姿，余桂芳．抗氧化劑N－乙酰半胱氨酸治療慢性乙型肝炎肝纖維化的療效［J］．廣東醫學，2013，34（6）：948－951．

［12］ NEW K J，REILLY M E，TEMPLETON K，et al．Free radicalmediated lipid peroxidation and systemic nitric oxide bioavailability：implications for postexercise hemodynamics［J］．Am J Hypertens，2013，26（1）：126－134．

［13］ IBRAHIM W H,HABIB H M,KAMAL H，et al．Mitochondrial superoxide mediates labile iron level:evidence from Mn－SOD transgenic mice and heterozygous knockout mice and isolated rat liver mitochondria［J］．Free Radic Biol Med，2013（65C）：143－149．

［14］秦小惠，古再麗努爾·艾麥提，邵偉，等．移植BMSCs對乳腺炎大鼠血清中自由基和抗氧化酶水平變化影響的研究［J］．現代生物醫學進展，2013，13（30）：5817－5820，5884．

［15］溫嘯，賀大方，倪雪勤，等．干酪乳桿菌與銀杏葉提取物對肥胖小鼠血脂及抗氧化功能的影響［J］．西北農林科技大學學報（自然科學版），2014，42（1）：1－12，17．

［16］周峰．煙酰胺對甲基苯丙胺注射后小鼠腦組織中脂質過氧化的影響［J］．江蘇醫藥，2014，40（1）：13－15．

［17］陳小賀，孟文格，劉永存，等．丙胺酰谷氨酰胺對外科危重癥患者免疫功能的提高作用［J］. 中國藥業，2013，22（10）：53-54.

［18］曹建偉，耿明飛，朱東山，等.谷氨酰胺聯合腸道微生態制劑對食管癌患者術后體液免疫的影響［J］.河南醫學研究，2015，24（3）：31-33.

［19］馮婭妮，孫艷紅，馬虹.谷氨酰胺預處理對HK-2細胞缺氧/復氧損傷的保護作用［J］. 實用藥物與臨床，2013，16（11）：993-997.

［20］李大鵬，李震，王剛，等.添加丙氨酰谷氨酰胺血液保存液對儲存紅細胞膜的影響［J］. 臨床輸血與檢驗，2015，17（1）：49-51.

［21］崔志勇.外源性抗氧化劑的補充對運動性疲勞的影響［J］.科技通報，2015，31（6）：13-15.

［22］呂曉芳，方立峰，馬瑞麗，等.早期腸外營養加用谷氨酰胺對重癥急性胰腺炎患者營養狀態的影響研究［J］.中國實用醫藥，2013，8（15）：104-105.

［23］馬建華，宋熔，楊瑛，等.腸外營養添加丙氨酰谷氨酰胺和大劑量維生素C對急性重癥創傷病人的治療效果［J］.齊魯醫學雜志，2013，28（6）：520-522.

［24］邱彩霞，于秋紅，薛連壁.阿爾茨海默病抗氧化治療的研究進展［J］. 北京醫學，2012，34（1）：47-49.

［25］張玉華.抗氧化劑硫辛酸對糖尿病周圍神經病變的臨床療效［J］. 藥物與臨床，2012，19（16）：68-69.